医用喜马拉雅旱獭油的脂质组学分析

苏勤, 卫海琳, 周国华, 张玲, 张评浒

苏勤, 卫海琳, 周国华, 张玲, 张评浒. 医用喜马拉雅旱獭油的脂质组学分析[J]. 实用临床医药杂志, 2024, 28(12): 21-25. DOI: 10.7619/jcmp.20233621
引用本文: 苏勤, 卫海琳, 周国华, 张玲, 张评浒. 医用喜马拉雅旱獭油的脂质组学分析[J]. 实用临床医药杂志, 2024, 28(12): 21-25. DOI: 10.7619/jcmp.20233621
SU Qin, WEI Hailin, ZHOU Guohua, ZHANG Ling, ZHANG Pinghu. Lipidomics analysis of medical Marmota himalayana oil[J]. Journal of Clinical Medicine in Practice, 2024, 28(12): 21-25. DOI: 10.7619/jcmp.20233621
Citation: SU Qin, WEI Hailin, ZHOU Guohua, ZHANG Ling, ZHANG Pinghu. Lipidomics analysis of medical Marmota himalayana oil[J]. Journal of Clinical Medicine in Practice, 2024, 28(12): 21-25. DOI: 10.7619/jcmp.20233621

医用喜马拉雅旱獭油的脂质组学分析

基金项目: 

青海省重大科技专项项目 2020-Z-02

详细信息
    通讯作者:

    张玲, E-mail: zlyz2005@163.com

    张评浒, E-mail: zhangpinghu@163.com

  • 中图分类号: R965.2;R917;R319

Lipidomics analysis of medical Marmota himalayana oil

  • 摘要:
    目的 

    对医用喜马拉雅旱獭油进行脂质组学分析并探讨其潜在生物学功效。

    方法 

    将喜马拉雅旱獭腹部脂肪加温提炼制成医用旱獭油, 基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)、超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术对2个批次的喜马拉雅旱獭油进行脂质组学分析,并结合脂质成分检测结果对喜马拉雅旱獭油的潜在功效进行分析。

    结果 

    GC-MS检测结果显示, 2个批次旱獭油的主要成分均为饱和脂肪酸(体积分数约为60%)和不饱和脂肪酸(体积分数约为30%), 饱和脂肪酸以棕榈酸、硬脂酸和花生酸为主,不饱和脂肪酸以油酸、亚油酸为主; 2个批次间,各种脂肪酸的体积分数均无显著差异,提示旱獭油的制备工艺稳定。UPLC-MS负离子模式检测结果显示,喜马拉雅旱獭油中含有15种饱和脂肪酸和18种不饱和脂肪酸,但2个批次间体积分数差异较大; UPLC-MS正离子模式检测结果显示, 2个批次旱獭油中均含有15种甘油二酯和30种甘油三酯。

    结论 

    本研究创新性应用GC-MS和UPLC-MS技术分析了医用喜马拉雅旱獭油的脂质组学成分,为后续探讨其药理活性及建立严格的质量控制标准提供了可靠依据。

    Abstract:
    Objective 

    To conduct lipidomics analysis of medical Marmota himalayana oil and explore its potential biological effects.

    Methods 

    Marmota himalayana abdominal fat was heated and refined to produce medical marmot oil. Lipidomics analysis of two batches of Marmota himalayana oil was performed using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS). The potential effects of Marmota himalayana oil were analyzed based on the results of lipid composition detection.

    Results 

    GC-MS results showed that the main components of the two batches of Marmota himalayana oil were saturated fatty acids (volume fraction of about 60%) and unsaturated fatty acids (volume fraction of about 30%). The saturated fatty acids were mainly palmitic acid, stearic acid, and arachidic acid, while the unsaturated fatty acids were mainly oleic acid and linoleic acid. There were no significant differences in the volume fraction of various fatty acids between the two batches, indicating that the preparation process of Marmota himalayana oil was stable. The results of UPLC-MS negative ion mode detection showed that Marmota himalayana oil contained 15 saturated fatty acids and 18 unsaturated fatty acids, but there were significant differences in volume fraction between the two batches. The results of UPLC-MS positive ion mode detection showed that Marmota himalayana oil of both batches contained 15 diglycerides and 30 triglycerides.

    Conclusion 

    This study innovatively applies GC-MS and UPLC-MS techniques to analyze the lipidomic components of medical Marmota himalayana oil, providing a reliable basis for subsequent exploration of its pharmacological activity and the establishment of strict quality control standards.

  • 喜马拉雅旱獭作为青藏高原特有种,是松鼠科中体型最大的冬眠动物,鉴于其携带鼠疫病原体的特性,现已成为鼠疫防控的关键监测对象[1-2]。本研究团队前期研究[3]发现,喜马拉雅旱獭与美洲旱獭具有较近的亲缘关系,目前为中国唯一适宜替代美洲旱獭,用作乙型肝炎和核苷类药物线粒体毒性评价模型的动物。经多年精心培育,喜马拉雅旱獭已正式成为中国地方特色实验动物新品种,且未来有望被纳入国家实验动物品种目录[4-5]。喜马拉雅旱獭具有极高的药用价值,其肉可用于驱寒,骨可作为虎骨替代品治疗骨伤,胆汁或可取代熊胆,旱獭油在西北地区民间则被广泛用于防治烧伤与冻伤[6]。本研究创新性应用气相色谱-质谱联用(GC-MS)、超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术对医用喜马拉雅旱獭油进行脂质组学分析,并对其潜在生物学功效进行分析,以期进一步开发喜马拉雅旱獭油的药用价值,并为建立医用喜马拉雅旱獭油的质量标准提供参考依据。

    旱獭油由青海喜马拉雅实验动物中心提供(将喜马拉雅旱獭腹部脂肪加温提炼,经高温高压消毒后分装备用)。甲氧胺盐酸盐、吡啶、1, 2-13C肉豆蔻酸、N-O-双(三甲硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)购自Sigma公司; LysoPE 17∶1、PE17∶0/17∶0、17∶0-17∶1-17∶0 d5TG购自Avanti公司; 甲醇、乙腈、异丙醇购自Merk公司; 甲酸、甲酸铵、乙酸铵购自国药集团化学试剂有限公司。

    U3000高效液相色谱仪(美国Dionex公司); Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); Trace 1310-TSQ8000 Evo三重四级杆气质联用仪(美国Thermo Fisher公司); Allegra 64R高速冷冻离心机(美国Beckman公司); Savant SPD1010真空离心浓缩仪(美国Thermo公司)。

    取50 μL旱獭油样本置于1.5 mL离心管中,加入200 μL甲醇溶液(含12.5 μg/mL的1, 2-13C肉豆蔻酸)充分涡旋后, 18 000 r/min离心10 min, 取上清100 μL置于离心浓缩仪中挥干(45 ℃, 15 kPa)获得提取样本,然后加入30 μL甲氧胺吡啶溶液(10 mg/mL)充分涡旋溶解, 30 ℃恒温振荡1.5 h, 加入30 μL BSTFA(含体积分数为1%的TMS),涡旋混匀, 37 ℃恒温振荡0.5 h, 样品衍生化结束后18 000 r/min离心10 min, 取上清液40 μL进样分析。

    取20 μL旱獭油样本置于1.5 mL离心管中,加入225 μL甲醇溶液(含5 μg/mL的LysoPE 17∶1、PE 17∶0/17∶0、17∶0-17∶1-17∶0 d5TG), 充分涡旋后加入750 μL甲基叔丁基醚(MTBE), 再次充分涡旋, 4 ℃振荡10 min, 加入188 μL超纯水再次充分涡旋, 18 000 r/min离心10 min, 取上清液350 μL置于离心浓缩仪中挥干(45 ℃, 15 kPa)获得干品。向干品中加入110 μL甲醇-甲苯(体积比9∶1)溶液,涡旋10 min, 超声波处理10 min, 然后18 000 r/min离心10 min, 取上清液80 μL进样分析。

    TG-5 MS毛细管色谱柱(0.25 mm×30.00 m, 0.25 μm), 按60 ℃(0~1 min)、60~320 ℃(1~14 min)、320 ℃(14~19 min)梯度升温; 分流比为20∶1, 进样量为1 μL。离子源为电子轰击电离(EI), 电离能量为70 eV, 离子传输线温度为250 ℃, 离子源工作温度为280 ℃, 采用全扫描方法模式,扫描范围m/z 50~500; 以高纯氦气(纯度>99.999%)作为载气,流速为1.2 mL/min。

    ① 色谱条件。使用ACQUITY CSH C18标准色谱柱(100.0 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 正离子流动相A为含10 mmol/L甲酸铵和体积分数为0.1%甲酸的乙腈-水(体积比6∶4)溶液,流动相B为含10 mmol/L甲酸铵和体积分数为0.1%甲酸的异丙醇-乙腈(体积比9∶1)溶液。负离子流动相A为含10 mmol/L乙酸铵的乙腈-水(体积比6∶4)溶液,流动相B为含10 mmol/L乙酸铵的异丙醇-乙腈(体积比9∶1)溶液。②梯度洗脱程序。0~2.0 min, 15%→30% B; >2.0~2.5 min, 30%→48% B; >2.5~11.0 min, 48%→82% B; >11.0~11.5 min, 82%→99% B; >11.5~12.0 min, 99%B; >12.0~13.0 min, 99%→15%B; >13.0~15.0 min, 15%B。流速为0.6 mL/min, 柱温为65 ℃。正离子模式、负离子模式进样量分别为2、3 μL。③质谱条件[8]。电喷雾离子源,喷雾电压为3 500 V(+)/3 000 V(-),鞘气压力为4 500 kPa, 辅助气压力为1 000 kPa, 离子源温度为325 ℃, 毛细管温度为300 ℃, 扫描范围m/z 215~1 800, S-lens电压50 V。

    应用MS-DIAL软件对采集的原始谱图文件进行峰提取、解卷积、二级质谱匹配等,导出生成数据矩阵并进行预处理。

    GC-MS检测结果(图 1)显示,旱獭油中体积分数最高的是饱和脂肪酸,且批次1与批次2样本中总饱和脂肪酸的体积分数相当,均约为60%; 其次是不饱和脂肪酸,且批次1与批次2样本中总不饱和脂肪酸的体积分数也基本相似,均约为30%; 2个批次样本中,饱和脂肪酸体积分数与不饱和脂肪酸体积分数的比例约为2∶1。饱和脂肪酸中,体积分数最高的为棕榈酸(2个批次样本均约为30%), 其后为硬脂酸、花生酸(2个批次样本体积分数均约为17%)。不饱和脂肪酸中,单不饱和脂肪酸主要为油酸(体积分数约为14%), 多不饱和脂肪酸主要为亚油酸(体积分数约为14%)。总体而言, 2个批次旱獭油样本中的各种脂肪酸体积分数均无显著差异,说明制备工艺稳定。

    图  1  喜马拉雅旱獭油的GC-MS检测结果

    UPLC-MS负离子模式检测结果(图 2)显示,喜马拉雅旱獭油中含有15种饱和脂肪酸和18种不饱和脂肪酸,批次1、批次2样本中的总饱和脂肪酸体积分数分别约为14.24%、16.59%, 总不饱和脂肪酸体积分数分别约为31%、5%, 2个批次间差异较大。2个批次样本间,除十六碳、十八碳、二十二碳饱和脂肪酸和十八碳不饱和脂肪酸的体积分数差异较大外,其余测得脂肪酸体积分数无显著差异。所有脂肪酸分子均能从LMSD数据库中搜索到。

    图  2  喜马拉雅旱獭油中脂肪酸的UPLC-MS负离子模式检测结果
    FA XY中, FA指脂肪酸, X指碳原子数, Y指双键数。

    UPLC-MS正离子模式检测结果显示, 2批旱獭油中均含有15种甘油二酯,见图 3。15种甘油二酯均为不饱和脂肪酸酰化甘油二酯,但2个批次样本的总体积分数差异较大,第1批次约为2.62%, 第2批次约为17.34%。除DG 23∶4、DG 24∶3和DG 25∶3这3种甘油二酯分子外,其余12种甘油二酯分子均可在LMSD数据库中检索到。

    图  3  喜马拉雅旱獭油中甘油二酯的UPLC-MS正离子模式检测结果
    DG XY中, DG指甘油二酯, X指碳原子数, Y指双键数。

    UPLC-MS正离子模式检测结果还显示, 2个批次旱獭油中均含有30种甘油三酯,见图 4。30种甘油三酯均为不饱和脂肪酸酰化的甘油三酯,其在批次1、批次2样本中的总体积分数分别为47.66%、36.23%。2个批次样本间,除TG 50∶1、TG 50∶3、TG 51∶2、TG 52∶1、TG 54∶1、TG 54∶6、TG 56∶1、TG 56∶4、TG 56∶5、TG 58∶1、TG 50∶1、TG 50∶1和TG 62∶3的体积分数无显著差异外,其余甘油三酯分子均存在较大差异。除TG 50∶2、TG 50∶3、TG 52∶4、TG 54∶2、TG 54∶4、TG 54∶5、TG 54∶6、TG 56∶4、TG 56∶5和TG 58∶2这10种甘油三酯分子外,其余20种甘油三酯分子均未在LMSD数据库中检索到。

    图  4  喜马拉雅旱獭油中甘油三酯的UPLC-MS正离子模式检测结果
    TG XY中, TG指甘油三酯, X指碳原子数, Y指双键数。

    本研究分别采用GC-MS、UPLC-MS检测方法对实验用喜马拉雅旱獭油的脂质组学进行详细分析,结果显示, 2个批次旱獭油均主要由饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸组成,其中饱和脂肪酸的体积分数约为60%, 不饱和脂肪酸的体积分数约为30%, 两者比例接近2∶1。饱和脂肪酸以棕榈酸、硬脂酸和花生酸为主,不饱和脂肪酸以油酸、亚油酸为主。2个批次旱獭油样本中的各种脂肪酸体积分数相似,表明旱獭油制备工艺稳定。

    棕榈酸是旱獭油中含量最丰富的饱和脂肪酸,这可能为旱獭油广泛的药理活性提供了关键支持。棕榈酸即软脂酸,普遍存在于人类饮食中,在维护生命健康及预防疾病发生发展方面具有重要作用[9]。于晓娟等[10]研究发现,棕榈酸可通过调控STAT3-PIAS3信号轴,有效抑制多种人源胃癌细胞的增殖与侵袭。LIN L等[11]通过体内实验证实,棕榈酸可通过抑制mTOR和Stat3通路蛋白的磷酸化,显著削弱肿瘤细胞的侵袭能力。除棕榈酸外,旱獭油中还含有花生酸、硬脂酸等多种对健康有益的饱和脂肪酸。研究[12]显示,花生酸对心脏病、糖尿病、肿瘤和衰老相关疾病等具有显著的缓解效果。HABIB N A等[13]发现,硬脂酸体内注射法能有效抑制乳腺癌大鼠肿瘤生长,提示硬脂酸及其衍生物或可成为潜在的抗肿瘤新药。旱獭油不仅富含饱和脂肪酸,还含有大量不饱和脂肪酸,其中单不饱和脂肪酸以油酸为主,多不饱和脂肪酸以亚油酸为主。亚油酸不仅对心血管健康有益,而且是CD8+T细胞活性的正向调节分子,能有效提升T细胞的代谢能力,防止T细胞耗竭,并促进T细胞向效应功能强大的记忆样表型转化。亚油酸处理的CAR-T细胞能长期维持抗癌活性,表明亚油酸有望作为过继性T细胞治疗癌症的增效剂[14]。然而,高棕榈酸或高亚油酸饮食模式可能加剧肿瘤转移风险[15],并增加糖尿病等慢性疾病[16]的发生风险,这可能与摄入量过大以及脂肪酸的特定类型相关。本研究所用喜马拉雅旱獭油为非食用品,目前主要用于烧伤、烫伤和冻伤等皮肤损伤的外用治疗,因而不会引发与食用相关的风险。

    脂质组学作为代谢组学的重要分支,自2003年由HAN X L等[17]首次提出以来,已在油类成分脂质分析[18]、品质判别[19]和产地溯源[20]等多个领域展现出广泛的应用前景。本研究创新性应用GC-MS技术和UPLC-MS技术对喜马拉雅旱獭油成分进行全面分析,成功规避了单一技术分析的局限性。例如,本研究GC-MS检测结果显示, 2个批次样本的成分基本一致,然而UPLC-MS检测结果显示, 2个批次样本在细微组成上存在显著差异,表明后续的样本制备工艺还需进一步优化,以确保旱獭油样本的稳定性。此外,本研究为单一来源的小样本量研究,后续研究可拓展至不同季节时的不同性别、年龄的喜马拉雅旱獭,以深入探究其油中的脂质组学成分的差异。

    综上所述,本研究创新性应用GC-MS和UPLC-MS技术分析了医用喜马拉雅旱獭油的脂质组学成分,为后续深入探讨其药理活性及建立严格的质量控制标准提供了参考数据。

  • 图  1   喜马拉雅旱獭油的GC-MS检测结果

    图  2   喜马拉雅旱獭油中脂肪酸的UPLC-MS负离子模式检测结果

    FA XY中, FA指脂肪酸, X指碳原子数, Y指双键数。

    图  3   喜马拉雅旱獭油中甘油二酯的UPLC-MS正离子模式检测结果

    DG XY中, DG指甘油二酯, X指碳原子数, Y指双键数。

    图  4   喜马拉雅旱獭油中甘油三酯的UPLC-MS正离子模式检测结果

    TG XY中, TG指甘油三酯, X指碳原子数, Y指双键数。

  • [1] 蒋可, 熊浩明, 靳海晓, 等. 喜马拉雅旱獭生态学研究进展[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2024, 35(1): 121-127. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZMSK202401022.htm
    [2] 李胜, 靳娟, 何建, 等. 我国喜马拉雅旱獭鼠与南方家鼠鼠疫疫源地鼠疫菌遗传特征研究[J]. 中国热带医学, 2023, 23(9): 916-921. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-RDYX202309005.htm
    [3] 张评浒, 张玲, 刘昌孝. 核苷类药物线粒体毒性评价模型的研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2020, 25(9): 1059-1065. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YLZL202009016.htm
    [4] 张评浒, 周国华, 徐楠, 等. 实验用喜马拉雅旱獭血常规及血生化参考指标的建立[J]. 扬州大学学报: 农业与生命科学版, 2019, 40(5): 70-74. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-JSNX201905012.htm
    [5] 刘海青, 范微, 张静宵, 等. 喜马拉雅旱獭实验动物化的研究进展[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(11): 64-68. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGDX201511014.htm
    [6] 王治军, 岳珊珑, 马英, 等. 喜马拉雅旱獭油治疗烧伤动物模型复制及疗效观察[J]. 动物学杂志, 2000, 35(4): 30-32. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-BIRD200004009.htm
    [7] 魏小曼. 结直肠腺瘤患者体质分型与肠道菌群及代谢组学的相关性研究[D]. 南京: 南京中医药大学, 2021.
    [8] 吴鹏. 基于代谢组学技术探讨温经活血外治法对早期膝骨关节炎的干预效应及机制研究[D]. 南京: 南京中医药大学, 2021.
    [9] 匡浩. 棕榈酸通过CD36活化内质网应激诱导结肠癌铁死亡的机制研究[D]. 武汉: 武汉大学, 2021.
    [10] 于晓娟. 棕榈酸通过阻滞STAT3信号通路抑制胃癌生长和转移[D]. 合肥: 安徽医科大学, 2021.
    [11]

    LIN L, DING Y, WANG Y, et al. Functional lipidomics: Palmitic acid impairs hepatocellular carcinoma development by modulating membrane fluidity and glucose metabolism[J]. Hepatology, 2017, 66(2): 432-448. doi: 10.1002/hep.29033

    [12]

    LEMAITRE R N, KING I B. Very long-chain saturated fatty acids and diabetes and cardiovascular disease[J]. Curr Opin Lipidol, 2022, 33(1): 76-82. doi: 10.1097/MOL.0000000000000806

    [13]

    HABIB N A, WOOD C B, APOSTOLOV K, et al. Stearic acid and carcinogenesis[J]. Br J Cancer, 1987, 56(4): 455-458. doi: 10.1038/bjc.1987.223

    [14]

    NAVA LAUSON C B, TIBERTI S, CORSETTO P A, et al. Linoleic acid potentiates CD8+ Tcell metabolic fitness and antitumor immunity[J]. Cell Metab, 2023, 35(4): 633-650.e9. doi: 10.1016/j.cmet.2023.02.013

    [15]

    PASCUAL G, DOMÍNGUEZ D, ELOSUA-BAYES M, et al. Dietary palmitic acid promotes a prometastatic memory via Schwann cells[J]. Nature, 2021, 599(7885): 485-490. doi: 10.1038/s41586-021-04075-0

    [16]

    VENØ S K, BORK C S, JAKOBSEN M U, et al. Linoleic acid in adipose tissue and development of ischemic stroke: a Danish case-cohort study[J]. J Am Heart Assoc, 2018, 7(13): e009820. doi: 10.1161/JAHA.118.009820

    [17]

    HAN X L, GROSS R W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry: a bridge to lipidomics[J]. J Lipid Res, 2003, 44(6): 1071-1079. doi: 10.1194/jlr.R300004-JLR200

    [18]

    LI Q Q, ZHAO Y, ZHU D, et al. Lipidomics profiling of goat milk, soymilk and bovine milk by UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass Spectrometry[J]. Food Chem, 2017, 224: 302-309. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.12.083

    [19]

    TU A Q, MA Q, BAI H, et al. A comparative study of triacylglycerol composition in Chinese human milk within different lactation stages and imported infant formula by SFC coupled with Q-TOF-MS[J]. Food Chem, 2017, 221: 555-567. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.11.139

    [20]

    LIM D K, MO C, LONG N P, et al. Simultaneous profiling of lysoglycerophospholipids in rice (Oryza sativa L. ) using direct infusion-tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring[J]. J Agric Food Chem, 2017, 65(12): 2628-2634. doi: 10.1021/acs.jafc.7b00148

图(4)
计量
  • 文章访问数:  108
  • HTML全文浏览量:  29
  • PDF下载量:  7
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2023-11-12
  • 修回日期:  2024-04-01
  • 网络出版日期:  2024-06-28
  • 刊出日期:  2024-06-27

目录

/

返回文章
返回