Effects of microRNA-127-3p on proliferation, invasion and migration of papillary thyroid cancer cells
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摘要:目的
探讨微小RNA-127-3p(miR-127-3p)对乳头状甲状腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响, 并明确miR-127-3p与肿瘤细胞侵袭抑制因子(SCAI)基因的靶向关系。
方法选取乳头状甲状腺癌细胞株TPC1、正常人甲状腺细胞株Nthy-ori 3-1为研究对象。将生长良好的TPC1细胞株根据转染方式的不同分为空白组(NC组，未进行任何处理)、miR-NC组(转染miR-127-3p过表达的空载体)、miR-127-3p组(转染miR-127-3p-mimics)、si-NC组(转染SCAI敲低空载体)和si-SCAI组(转染si-SCAI)。采用噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖能力, Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力，实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞中miR-127-3p、SCAI mRNA的表达水平，蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞SCAI蛋白表达水平。采用生物信息预测miR-127-3p与SCAI的靶向作用关系，并使用荧光素酶报告实验进行验证。
结果TPC1细胞中的miR-127-3p表达水平低于Nthy-ori 3-1细胞, SCAI蛋白、SCAI mRNA表达水平高于Nthy-ori 3-1细胞，差异有统计学意义(P < 0.01)。与NC组、miR-NC组比较, miR-127-3p组细胞48、72 h时的增殖能力、细胞迁移和侵袭能力降低，差异有统计学意义(P < 0.01)。与NC组、si-NC组比较, si-SCAI组细胞48、72 h时的增殖能力、细胞迁移和侵袭能力升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。与NC组和miR-NC组比较, miR-127-3p组SCAI蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。转载WT-SCAI的miR-127-3p组细胞荧光素酶活性高于转载WT-SCAI的NC组细胞，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论乳头状甲状腺癌细胞中的miR-127-3p、SCAI呈低表达，过表达miR-127-3p可能通过促进SCAI的表达抑制乳头状甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。
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关键词:
- 微小RNA-127-3p /
- 肿瘤细胞侵袭抑制因子 /
- 乳头状甲状腺癌 /
- 侵袭 /
- 转移 /
- 增殖
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of microRNA-127-3p (miR-127-3p) on proliferation, invasion and migration of papillary thyroid cancer cells, and to clarify the targeting relationship between miR-127-3p and tumor cell invasion inhibitor (SCAI) gene.
MethodsPapillary thyroid carcinoma cell line TPC1 and normal human thyroid cell line Nthy-ori 3-1 were selected as study objects.The well-grown TPC1 cell lines were divided into blank group (NC group, without treatment), miR-NC group (transfected with miR-127-3p overexpressed empty vector), miR-127-3p group (transfected miR-127-3p-mimics), si-NC group (transfected with empty vector of knockdown SCAI) and si-SCAI group (transfected si-SCAI) according to different transfection modes. The cell proliferation was detected by Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT); cell migration and invasion was detected by transwell assay; the levels of miR-127-3p and SCAI mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR); the expression of SCAI protein was detected by Western blot.The relationship between miR-127-3p and SCAI was predicted by bioinformatics, and luciferase assay was used to verify its reliability.
ResultsThe level of miR-127-3p in TPC1 cells was lower than that in Nthy-ori 3-1 cells, and the levels of SCAI protein and SCAI mRNA were higher than those in Nthy-ori 3-1 cells (P < 0.01). Compared with NC group and miR-NC group, the abilities of proliferation, cell migration and invasion of the miR-127-3p group were decreased at 48 and 72 h (P < 0.01). Compared with NC group and Si-NC group, the proliferation ability, cell migration and invasion ability of the si-SCAI group increased at 48 and 72 h, and the differences were statistically significant (P < 0.01). Compared with NC and miR-NC groups, the level of SCAI protein in the miR-127-3p group was higher (P < 0.01).The luciferase activity of cells transfected with WT-SCAI in the miR-127-3p group was higher than that of cells transfected with WT-SCAI in the NC group (P < 0.05).
ConclusionThe expression of miR-127-3p and SCAI is low in papillary thyroid carcinoma cells.The miR-127-3p overexpression may inhibit the proliferation, invasion and migration of papillary thyroid carcinoma cells by promoting SCAI expression.
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尽管多数乳头状甲状腺癌患者经过综合治疗后预后良好，但仍有部分患者出现远处转移。微小RNA在肿瘤复发中扮演着重要角色[1-2]。研究[3]表明，宫颈癌组织微小RNA-127-3p(miR-127-3p)表达降低，可抑制宫颈癌细胞恶性生物学行为。miR-127-3p过表达可抑制黑色素瘤细胞的增殖、侵袭及转移，诱导肿瘤细胞凋亡[4]。但miR-127-3p与甲状腺癌恶性表型的关系无文献报告。肿瘤细胞侵袭抑制因子(SCAI)在肿瘤组织中异常表达，参与调控肿瘤的恶性表型[5-7], 但SCAI与乳头状甲状腺癌的关系尚不清楚。研究[7-8]显示, SCAI与多种微小RNA存在靶向关系，参与调控肿瘤的恶性表型。但miR-127-3p与SCAI的关系未知。本研究分析miR-127-3p对乳头状甲状腺癌恶性表型的影响及其作用机制。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂、细胞株及仪器
选取乳头状甲状腺癌细胞TPC1、正常人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1(本实验保存)。主要试剂和仪器主要包括: 引物、miR-127-3p过表达载体(mimics)、miR-NC(miR-127-3p过表达的空载体)、对照质粒、si-NC、si-SCAI、突变型(MUT)-SCAI、野生型(WT)-SCAI(广州云舟生物科技股份有限公司); 鼠抗人SCAI、β-actin、羊抗鼠二抗(沈阳万类康生物有限公司); RNA提取、聚合酶链反应(PCR)试剂盒，转染试剂盒(广州云舟生物科技股份有限公司); 氯化丙定(PI)(广州云舟生物科技股份有限公司); 荧光素酶检测试剂盒(大连医友生物有限公司); 噻唑蓝(MTT, 大连医友生物有限公司); Transwell小室(Corning，美国); 酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司); PCR仪(杭州奥盛仪器有限公司)。
1.2 细胞培养、转染及分组
利用完全DMEM培养基培养细胞，培养箱条件设置为37 ℃、5%CO2, 隔日传代、换液。取生长良好的TPC1细胞，将质粒及Lip 2000一起加入到细胞培养基中进行转染，分为空白组(NC组，无处理)、miR-NC组(转染miR-127-3p过表达的空载体)、miR-127-3p组(转染miR-127-3p-mimics)、si-NC组(转染SCAI敲低空载体)和si-SCAI组(转染si-SCAI)。
1.3 实时荧光定量PCR检测miR-127-3p、SCAI mRNA水平
取对数生长期的细胞，利用Trizol提取总RNA, 检测浓度，逆转录cDNA: 10 mmol/L dNTP1.5 μL, 5×PCR buffer 5 μL, 反转录酶1 μL, DEPC水2.5 μL, 总体积25 μL。然后采用PCR扩增，引物序列见表 1。反应体系: SYBR ® Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL+上下游引物(10 μmol/L) 1 μL, 加DEPC水，总体积为25 μL。反应参数: 95 ℃ 1 min、90 ℃ 20 s、50 ℃ 15 s, 共40个循环。2-△△Ct法表示表达量。内参为 U6 、GAPDH。所有实验均重复3次。
表 1 目标引物序列基因 上游 下游 miR-127-3p 5′-GACCCAGTTCAAGTAATTCAG-3′ 5′-CGAGCCAAGTAATGGAGAA-3′ SCAI 5′-CGGCTACATTGTCTGCCTG-3′ 5′-CAGTGC GTGTCGTGGAGT-3′ GAPDH 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′ 5′-GGCATGGACTGTGGTTGAG-3′ U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ 1.4 MTT实验
将细胞接种于96孔板，培养箱继续培养，分别于0、48、72、96 h检测细胞活力，检测前加入20 μL MTT, 培养4 h, 然后加入150 μL DMSO, 水平摇床摇动30 min，上机检测光密度(OD)值。每组5个复孔。
1.5 Transwell小室实验
迁移实验: 上室中加入1×105个细胞，用无血清培养基配制，下室加入含20%血清培养基, 48 h后去除上室未穿细胞，用4%多聚甲醛固定, 0.1%结晶紫染色，洗涤，计数。侵袭实验: 首先用DMEM培养基按照1∶8稀释基质胶，上室中加40 μL基质胶，其余同上。所有实验均重复3次。
1.6 Western blot法检测SCAI蛋白的表达
去除培养基，加入裂解液提取总蛋白。配制3%胶，点样, SDS-PAGE电泳2 h将蛋白转移至膜上, 5%脱脂奶粉封闭1 h, 加入SCAI(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗体冰箱过夜，次日加入二抗(1∶1 000), 室温1 h, 洗涤3次后上机曝光, Image J软件分析光密度。所有实验均重复3次。
1.7 荧光素酶实验验证miR-127-3p与SCAI的靶向关系
分别将MUT-SCAI、WT-SCAI质粒分别转入NC组和miR-127-3p组, 48 h后检测各组细胞荧光活性。所有实验均重复3次。
1.8 统计学方法
使用SPSS11.0软件处理和分析数据，计量资料以(x±s)表示, 2组间比较行t检验，多组比较行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 乳头状甲状腺癌细胞、正常人甲状腺细胞中的miR-127-3p表达
TPC1细胞中的miR-127-3p表达水平低于Nthy-ori 3-1细胞，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图 1。
2.2 乳头状甲状腺癌细胞及正常甲状腺细胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA表达
TPC1细胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA表达均低于Nthy-ori 3-1细胞，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图 2。
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图 2 TPC1细胞和Nthy-ori 3-1细胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA的表达A: Western blot检测SCAI蛋白; B: 各组SCAI蛋白表达水平; C: 各组SCAI mRNA表达水平。与TPC1细胞比较, **P＜0.01。2.3 miR-127-3p过表达对TPC1细胞增殖、迁移和侵袭的影响
miR-127-3p组细胞中的miR-127-3p表达水平高于NC组、miR-NC组，差异有统计学意义(P＜0.05), 但NC组、miR-NC组的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。miR-127-3p组48、72 h细胞OD值、迁移和侵袭细胞数量低于NC组、miR-NC组，差异有统计学意义(P＜0.05); NC组、miR-NC组的细胞活力、细胞迁移和细胞侵袭数量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 3。
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图 3 miR-127-3p过表达对TPC1细胞增殖、迁移和侵袭的影响A: 各组miR-127-3p表达水平; B: MTT结果; C: 迁移实验及侵袭实验。与miR-127-3p组比较, *P＜0.05。2.4 抑制SCAI表达对TPC1细胞增殖、迁移和侵袭的影响
si-SCAI组细胞中SCAI蛋白及SCAI mRNA水平低于NC组、si-NC组，差异有统计学意义(P＜0.05), 但NC组、miR-NC组细胞中SCAI蛋白及SCAI mRNA水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。si-SCAI组48、72 h细胞OD值、迁移和侵袭细胞数量高于NC组、si-NC组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 4。
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图 4 抑制SCAI表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响A、B: 各组SCAI蛋白水平; C: 各组SCAI mRNA水平; D: 增殖能力检测; E: 迁移实验; F: 侵袭实验; G: 各组侵袭、迁移实验典型图(放大20倍)。与si-SCAI组比较, *P＜0.05。2.5 各组细胞SCAI蛋白表达
miR-127-3p组SCAI蛋白表达水平高于NC组、miR-NC组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 5。
2.6 miR-127-3p与SCAI的靶向关系
生物信息分析显示, miR-127-3p与SCAI存在互补碱基。转载WT-SCAI的miR-127-3p组细胞荧光素酶活性高于转载WT-SCAI的NC组细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 6。
3. 讨论
大量文献[9-12]报道，微小RNA在乳头状甲状腺癌进展中发挥重要作用。miR-127-3p在多种肿瘤组织中高表达。研究[13]表明，下调miR-127-3p能抑制肝癌进展。miR-127-3p可抑制黑色素瘤细胞的恶性行为，促进凋亡[14]。研究[15]发现，卵巢癌患者血清miR-127-3p与临床病理特征有关。本研究结果显示，乳头状甲状腺癌细胞中miR-127-3p呈低表达，提示miR-127-3p可能是乳头状甲状腺癌的抑癌基因。为了进一步研究miR-127-3p在乳头状甲状腺癌发生、发展中的作用，本研究构建了miR-127-3p过表达乳头状甲状腺癌细胞，并分析了其对肿瘤细胞恶性表型的影响。结果显示, miR-127-3p过表达的细胞增殖、侵袭及迁移能力显著降低。研究[16-20]发现, miR-127在前列腺癌、膀胱癌及结肠癌组织中呈低表达，机制可能是miR-127启动子区域的异常甲基化，通过去甲基化药物激活miR-127表达，并抑制其靶标B细胞淋巴瘤细胞6(Bcl-6)抑制肿瘤发生。
miR-127-3p靶向多个基因行使其功能，如miR-127-3p可通过靶向MAPK4抑制卵巢癌肿瘤的生长[21]。另外, miR-127-3p可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤细胞的增殖[22]。SCAI是一种抑癌基因，参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。另外，在多种肿瘤中SCAI可被多种微小RNA抑制[23-24]。本研究结果显示，乳头状甲状腺癌细胞中SCAI呈高表达，抑制SCAI后增强了细胞恶性生物学行为，提示SCAI与肿瘤进展有关。许娟秀等[25]研究发现, miR-135a可靶向SCAI抑制宫颈癌糖酵解。研究[26]发现，在肝癌细胞中SCAI可作为miR-425-5p的靶基因，当其被miR-425-5p抑制后可以促进肝癌细胞的上皮间质转化(EMT)和转移。上述结果证实，miR-127-3p通过负向调控SCAI的表达抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。
综上所述，乳头状甲状腺癌中miR-127-3p呈低表达，可抑制细胞恶性生物学行为，机制可能与靶向SCAI有关，但具体机制有待进一步探讨。
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图 2 TPC1细胞和Nthy-ori 3-1细胞中SCAI蛋白、SCAI mRNA的表达
A: Western blot检测SCAI蛋白; B: 各组SCAI蛋白表达水平; C: 各组SCAI mRNA表达水平。与TPC1细胞比较, **P＜0.01。
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图 3 miR-127-3p过表达对TPC1细胞增殖、迁移和侵袭的影响
A: 各组miR-127-3p表达水平; B: MTT结果; C: 迁移实验及侵袭实验。与miR-127-3p组比较, *P＜0.05。
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图 4 抑制SCAI表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响
A、B: 各组SCAI蛋白水平; C: 各组SCAI mRNA水平; D: 增殖能力检测; E: 迁移实验; F: 侵袭实验; G: 各组侵袭、迁移实验典型图(放大20倍)。与si-SCAI组比较, *P＜0.05。
表 1 目标引物序列
基因 上游 下游 miR-127-3p 5′-GACCCAGTTCAAGTAATTCAG-3′ 5′-CGAGCCAAGTAATGGAGAA-3′ SCAI 5′-CGGCTACATTGTCTGCCTG-3′ 5′-CAGTGC GTGTCGTGGAGT-3′ GAPDH 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′ 5′-GGCATGGACTGTGGTTGAG-3′ U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ 
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期刊类型引用(1)
1. 王继绪，张国栋，陈茂丽，韩永峰. 乙型肝炎病毒相关性肝细胞肝癌患者血清miR-125a-5p、 miR-127-3p表达及临床意义. 国际检验医学杂志. 2024(15): 1860-1866 . 
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