Effect and mechanism of oxyhydrogen machine in antifungal adjuvant therapy
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摘要:目的
基于体外试验研究氢氧机单独应用或联用抗真菌药对真菌的作用效果及作用机制。
方法选择临床分离获得的12株病原真菌作为试验菌株, 使用氢氧机按固定的流速和档位(气流量3 L/min, 雾化档5档)处理菌悬液，以通气0 min时(未通气时)和通气处理菌悬液5、10 min时为3个观察时点，各时点分别取菌悬液100 μL涂布于沙氏葡萄糖琼脂培养基，于37 ℃温箱内培养2 d后进行菌落计数，计算存活率和杀伤率。采用微量液基稀释法测定4种抗真菌药伏立康唑(VOR)、泊沙康唑(POS)、氟康唑(FLU)、伊曲康唑(ITR)的最低抑菌浓度(MIC)。应用流式细胞仪测定细胞内活性氧(ROS)活性变化。
结果氢氧机5 min通气处理对12株菌株的杀伤率与通气0 min比较，差异均有统计学意义(P < 0.05), 整体杀伤率范围为6.3%~76.2%; 与5 min通气处理相比，氢氧机10 min通气处理对12株菌株的杀伤率增高，差异均有统计学意义(P < 0.05), 整体杀伤率范围为19.6%~93.5%。菌悬液体外药敏试验结果显示，氢氧机通气处理10 min后, ITR、POS、VOR对菌株的MIC值下降了1~4倍, FLU对菌株的MIC值降低了1~5倍; 高浓度氢气处理后，抗真菌药对其中11株菌株的MIC值明显降低。对经过不同时间通气处理的ATCC00279菌株进行细胞内ROS检测发现，与通气0 min比较，通气10 min后菌株对ITR、VOR的ROS百分比增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论单独氢氧机通气处理即可实现高达93.5%的菌株杀伤效果，将其与抗真菌药联用还可使菌株对药物的敏感性增强，进一步降低抗真菌药对真菌的MIC，其机制可能与氢氧机能增强真菌细胞内ROS活性有关。
Abstract:ObjectiveTo explore antifungal effect and mechanism of oxyhydrogen machine alone or combined with antifungal agents based on in vitro study.
MethodsTwelve strains of clinically isolated pathogenic fungi were selected as study strains, and the bacterial suspension was treated with a hydrogen-oxygen machine at a fixed flow rate and gear (gas flow rate of 3 L/min at the fifth atomization gear position). 100 μL of bacterial suspension was respectively coated on Sarge glucose AGAR medium at 0 min of ventilation (without ventilation) and 5 and 10 min of ventilation for bacterial suspension, and colony counts were performed after the medium was cultured at 35℃ for 2 days. Survival rate and kill rate were calculated. The minimal inhibitory concentrations (MICs) were evaluated before or after oxyhydrogen treatment for four antifungal drugs: voriconazole (VOR), posaconazole (POS), fluconazole (FLU), itraconazole (ITR). The intracellular reactive oxygen species (ROS) activity was measured by flow cytometry.
ResultsThe killing rate of 12 strains after 5 min ventilation by hydrogen oxygen machine showed significant difference compared with that at 0 min of ventilation (P < 0.05). The overall killing rate ranged from 6.3% to 76.2%. The killing rate of 12 strains at 10 min of ventilation by hydrogen oxygen machine increased compared with 5 min of ventilation(P < 0.05), with the overall killing rate of 19.6% to 93.5%. The results of external drug sensitivity test of bacterial suspension liquid showed that the MIC values of ITR, VOR, and POS against the strains after 10 min treatment were decreased 1 time to 4 times, and the MIC value of FLU against the strains was reduced 1 time to 5 times. After treatment with high concentration of hydrogen, the MICs of antifungal agents against 11 strains were significantly decreased. The intracellular ROS detection of ATCC00279 strain after different time of ventilation showed that the percentage of ROS in strains by ITR and VOR increased after 10 min of ventilation compared with 0 min of ventilation (P < 0.05).
ConclusionDirectly ventilation by oxyhydrogen machine enables to obtain direct killing of up to 93.5% of the pathogenic fungi. Oxyhydrogen treatment combined with antifungal drugs can increase the susceptibility of the strain to the drugs to further decrease MIC of antifungal agents against fungi. The mechanisms might be associated with the increased intracellular ROS activity of fungal cells by oxyhydrogen machine.
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真菌广泛存在于呼吸道、生殖道、消化道、口腔和皮肤等处[1], 大部分为机会致病菌[2], 可引起浅部真菌感染和深部真菌感染[3], 其中深部真菌感染是常见的院内感染类型之一[4]。由于缺乏特异性表现，真菌感染的临床诊断极其困难，且治疗难度大，治疗成本高[5]。因此，探寻新型的抗真菌治疗方案和抗真菌药协同治疗策略对于改善患者预后具有积极意义。氢氧机是利用电解水技术制备氢气、氧气的设备，医疗用氢氧气雾化机主要由电解槽和超声雾化系统组成，通过提供氢氧混合气体经呼吸系统进入人体起治疗作用，也可与雾化药液混合后进行雾化吸入、湿化治疗[6-7]。本研究使用氢氧机制备的氢氧混合气体对临床常见的致病真菌进行体外处理，观察不同处理时间的真菌杀伤效果，并检测处理后真菌对唑类抗真菌药的敏感性变化，以期为临床单独应用氢氧机或联用抗真菌药治疗真菌感染提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
选取长江大学附属荆州医院真菌试验室保存的12株临床分离真菌作为试验菌株，分别为白念珠菌R9、R14、R15、SC5314, 耳念珠菌AR382、AR387、AR389(购自美国CDC)，克柔念珠菌ATCC00279, 近平滑念珠菌ATCC22019, 新生隐球菌Z1、Z2、Z3。药敏试验质控菌株为近平滑念珠菌(ATCC22019)。试验药物包括泊沙康唑(POS)、伊曲康唑(ITR)、氟康唑(FLU)和伏立康唑(VOR)(购自Selleck公司)。氢氧机购自阿斯克勒庇俄斯医学(南通)有限公司，型号BYT-JP-H03。一次性无菌管购自北京红祥聚科贸易有限公司，生产批号H0081031。
1.2 氢氧机对真菌的体外杀伤试验
① 菌悬液制备: 以沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基培育真菌2 d后用无菌生理盐水收集孢子，再使用血细胞计数板调整孢子浓度为2×106 CFU/mL。②菌液稀释: 将制备好的12株菌株的菌悬液用RPMI-1640液体培养基稀释至终浓度2×104 CFU/mL, 分别取10 mL分装于50 mL EP管中。③氢氧机通气处理: 使用一次性无菌管分别接入氢氧机出气口和装有菌悬液的50 mL EP管中，并确保通气部位在菌悬液底部。氢氧机开机后，设置气流量为3 L/min, 雾化档为5档。以通气0 min时(未通气时)和通气处理菌悬液5、10 min时为3个观察时点，各时点分别取菌悬液100 μL, 用玻璃珠涂布于SDA培养基，于37 ℃温箱内培养2 d后进行菌落计数。所有试验操作重复3次。
1.3 体外药敏试验
按照美国临床试验室标准化研究所(CLSI)颁布的M27-A4文件中的微量液基稀释法，配置RPMI 1640液体培养基。将试验药物VOR、POS、FLU和ITR分为8个浓度梯度，工作浓度范围分别为0.031~4.000 μg/mL、0.031~4.000 μg/mL、0.500~64.000 μg/mL和0.063~8.000 μg/mL。倍比稀释4种药物，将稀释后的药物分别加入96孔板，设立无药孔为生长对照孔，剩余每孔再加入倍比稀释后药物100 μL和菌悬液100 μL, 35 ℃温箱中培养24 h后读取最低抑菌浓度(MIC)结果。每个药敏试验重复3次，质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019。
1.4 细胞内活性氧(ROS)检测
采用双氢罗丹明123(DHR-123, 购自Sigma-Aldrich公司，货号NO.D1054, 将粉状荧光染料溶解于二甲亚砜)检测细胞内ROS。取3个观察时点的菌悬液，分别配置6管10 mL孢子浓度为5×106 CFU/mL的沙氏葡萄糖水液体培养基菌悬液，取其中1管不做处理，其余5管分别加入DHR-123(5.000 μg/mL), 再取5管中的4管分别加入浓度不同的4种药物(每管加其中1种药物)，即ITR(0.250 μg/mL)、VOR(0.125 μg/mL)、POS(0.500 μg/mL)、FLU(0.250 μg/mL)。将配置好的菌悬液放入摇箱中于37 ℃、130转/min条件下振荡培养30 min。取培养后的菌液离心(2 000~4 000转/min) 5~10 min, 去除上清后以5 mL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)重复洗涤2次。洗涤后重悬细胞于5 mL SDA液体培养基中，放入摇箱以37 ℃、130转/min振荡培养60 min, 取经第2次培育后的菌液离心(2 000~4 000转/min) 5~10 min, 去除上清后加入1 mL预冷的PBS重悬。取150 μL重悬液置于流式管中，使用流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号B53000)进行检测。
1.5 统计学分析
采用统计学软件SPSS 19.0分析数据，计数资料比较行卡方检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 氢氧机不同通气时间对真菌菌株的杀伤情况
氢氧机5 min通气处理对12株菌株的杀伤率与通气0 min比较，差异均有统计学意义(P < 0.05), 整体杀伤率范围为6.3%~76.2%, 其中对4株白念珠菌的杀伤率范围为9.0%~49.6%, 对3株耳念珠菌的杀伤率范围为6.3%~20.9%, 对3株新生隐球菌的杀伤范围为10.3%~76.2%, 对克柔念珠菌的杀伤率为21.1%, 对近平滑念珠菌的杀伤率为37.8%。与5 min通气处理相比，氢氧机10 min通气处理对12株菌株的杀伤率增高，差异均有统计学意义(P < 0.05), 整体杀伤率范围为19.6%~93.5%, 其中对4株白念珠菌的杀伤率增至23.1%~53.4%, 对3株耳念珠菌的杀伤率增至23.9%~49.7%, 对3株新生隐球菌的杀伤率增至19.6%~93.5%, 对克柔念珠菌的杀伤率增至39.5%, 对近平滑念珠菌的杀伤率增至46.1%。由此可见, 5 min通气处理即可显著改变对真菌的杀伤效果，但10 min通气处理对真菌的杀伤效果显著更优，故10 min是更合适的通气处理时间。经高浓度氢气处理后，孢子数明显减少，说明高浓度氢气通气处理对真菌菌株产生了明显的杀伤效果。菌株生长状况见图 1, 各菌株残余孢子数量见图 2, 通气不同时间后各菌株孢子存活率见表 1。
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图 2 各菌株经不同时间通气处理后的残余孢子数量比较两者比较, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1, ns为P>0.05。表 1 通气不同时间后各菌株的孢子存活率% 菌株 菌种 0 min 5 min 10 min 382 耳念珠菌 100.0 79.1 50.3 387 耳念珠菌 100.0 80.6 76.1 389 耳念珠菌 100.0 93.7 70.5 Z1 新生隐球菌 100.0 23.8 6.5 Z2 新生隐球菌 100.0 89.7 81.0 Z3 新生隐球菌 100.0 89.1 75.5 SC5314 白念珠菌 100.0 50.4 46.6 ATCC00279 克柔念珠菌 100.0 27.5 17.4 ATCC22019 近平滑念珠菌 100.0 62.2 53.9 R9 耐氟康唑白念珠菌 100.0 91.0 76.9 R14 耐氟康唑白念珠菌 100.0 98.6 97.3 R15 耐氟康唑白念珠菌 100.0 83.6 81.3 2.2 体外药敏试验结果
与未经通气处理时相比，通气处理10 min后，大部分菌株表现出对抗真菌药更加敏感。对于白念珠菌, ITR的MIC从0.250~1.000 μg/mL降至0.125~1.000 μg/mL, POS的MIC从0.063~0.500 μg/mL降至0.063~0.250 μg/mL, FLU的MIC从0.500~8.000 μg/mL降至0.125~4.000 μg/mL; 对于耳念珠菌, ITR的MIC从0.125~4.000 μg/mL降至0.125~1.000 μg/mL, VOR的MIC从0.250~4.000 μg/mL降至0.250~2.000 μg/mL, POS的MIC从0.063~4.000 μg/mL降至0.063~0.500 μg/mL, FLU的MIC从4.000~64.000 μg/mL降至2.000~64.000 μg/mL; 对于克柔念珠菌, ITR的MIC从0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL, VOR的MIC从0.125 μg/mL降至0.063 μg/mL, POS的MIC从0.500 μg/mL降至0.031 μg/mL, FLU的MIC从0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL; 对于近平滑念珠菌, ITR的MIC从0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL, VOR的MIC从0.125 μg/mL降至0.063 μg/mL, POS的MIC从0.500 μg/mL降至0.250 μg/mL, FLU的MIC从2.000 μg/mL降至0.063 μg/mL; 对于新生隐球菌, ITR的MIC从0.125~0.250 μg/mL降至0.063~0.250 μg/mL, FLU的MIC从2.000~4.000 μg/mL降至0.500~2.000 μg/mL。药敏试验结果显示，经过高浓度氢气处理后，抗真菌药对11株真菌的MIC值明显降低，说明高浓度氢气处理可使菌株对药物的敏感性增强，起到协同杀伤效果。见表 2。
表 2 4种抗真菌药对12株真菌的体外药敏试验最低抑菌浓度结果μg/mL 菌株编号 种属 ITR VOR POS FLU 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min AR387 耳念珠菌 0.125 0.125 0.125 0.250 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 64.000 64.000 64.000 AR389 耳念珠菌 2.000 1.000 1.000 4.000 2.000 2.000 1.000 0.500 0.250 4.000 2.000 2.000 R9 白念珠菌 1.000 0.250 0.250 0.500 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 4.000 2.000 1.000 R14 白念珠菌 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.250 0.250 4.000 2.000 2.000 R15 白念珠菌 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.500 0.250 0.125 8.000 4.000 4.000 Z1 新生隐球菌 0.250 0.250 0.250 0.031 0.031 0.031 0.250 0.250 0.250 2.000 1.000 1.000 Z2 新生隐球菌 0.125 0.063 0.063 0.031 0.031 0.031 0.250 0.250 0.250 2.000 0.500 0.500 Z3 新生隐球菌 0.250 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 0.500 0.250 0.250 4.000 4.000 2.000 SC5314 白念珠菌 0.250 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.063 0.063 0.500 0.125 0.125 ATCC00279 克柔念珠菌 0.250 0.125 0.063 0.125 0.125 0.063 0.500 0.250 0.031 0.250 0.250 0.063 ATCC22019 近平滑念珠菌 0.250 0.250 0.063 0.125 0.125 0.063 0.500 0.250 0.250 2.000 1.000 0.063 AR382 耳念珠菌 4.000 2.000 1.000 4.000 1.000 0.250 4.000 2.000 0.500 64.000 64.000 64.000 ITR: 伊曲康唑; VOR: 伏立康唑; POS: 泊沙康唑; FLU: 氟康唑。 2.3 细胞内ROS检测结果
根据药敏试验结果以及存活率结果筛选出克柔念珠菌ATCC00279进行ROS检测，见图 3。相较于通气处理0 min, 通气处理10 min后的ATCC00279对4种唑类抗真菌药的ROS百分比均有所增加，其中ATCC00279对ITR和VOR的ROS百分比差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 4。由此表明，高浓度氢气处理会对菌株产生明显杀伤效果，导致孢子数目减少，且菌株细胞内ROS比例增加，使其对唑类抗真菌药的敏感性增强。
3. 讨论
临床常见的真菌主要包括念珠菌、曲霉菌和隐球菌等，广泛存在于呼吸道、生殖道、消化道、口腔及体表皮肤等部位，其中白念珠菌、新型隐球菌和烟曲霉菌是导致真菌感染最重要的3大致病菌[8-9]。真菌性疾病在国内外人群中的发病率均较高，为20%~25%, 可对人们的身心健康造成重大损害[10]。临床常见的深部真菌感染的发生往往与广谱抗菌药物、免疫抑制剂的广泛使用，导管技术、器官移植的开展，以及艾滋病、恶性肿瘤患者和老年患者的增加等因素有关[11-12]。念珠菌是深部真菌感染排名首位的病原菌，其后是曲霉菌和隐球菌[3]。隐球菌引起的深部真菌感染主要侵犯中枢神经系统及肺[13], 造成隐球菌性脑膜炎和肺炎。相关研究[14]称, 40岁以上慢性阻塞性肺疾病患者合并真菌感染的概率为25%~40%。临床较少见的耳念珠菌有着“超级真菌”之称，具有多重耐药性，一旦感染往往难以治疗且流行难以控制[15]。目前，侵袭性真菌感染尚无很好的临床治疗方法，深部真菌感染更是严重影响患者转归，且随着耐药菌株的增加抗菌药的临床应用受到限制[16], 导致患者住院时间延长，甚至危及生命健康。
2020年2月2日，氢氧气雾化机被国家药品监督管理局批准作为三类呼吸医疗设备用于慢性阻塞性肺疾病的辅助治疗，可改善呼吸困难、咳嗽、咳痰等症状。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》、《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》均将氢气治疗作为推荐治疗方法，使得氢气的临床价值逐渐引起重视[17]。本研究选取临床常见的深部致病真菌12株，使用氢氧机制备的氢氧混合气体对其进行体外处理，发现氢氧混合气体在体外对真菌孢子均有不同程度的杀伤效果，其中对新生隐球菌、白念珠菌的杀伤效果尤为明显，对耳念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌亦表现出较好的杀伤效果。同时，体外药敏试验结果显示，氢氧机通气处理与唑类抗真菌药对上述真菌孢子的协同杀伤效果明显，即氢氧机通气可提高真菌孢子对唑类抗真菌药的敏感性，表明氢气在真菌感染性疾病治疗方面或许有较好的前景。
氢气的具体作用机制目前尚未明确，本研究提示氢气对孢子具有高抑制效果，其可能机制是高浓度的氢气打破了真菌微生物的氧化-抗氧化平衡，甚至有可能直接作用于微生物线粒体而影响孢子的能量代谢[17]。本研究还发现，经通气处理后，菌株细胞内ROS比例增加，对4种唑类抗真菌药的敏感性增强。研究[18]证实ROS对孢子具有杀伤效应，细胞内蓄积的ROS氧化细胞内的DNA、蛋白、脂质及细胞器，从而引起氧化应激，被ROS氧化的蛋白及脂质不仅会失去应有功能，而且易在细胞内聚集形成脂褐素等毒性物质，并通过影响溶酶体的活性而引起细胞死亡。另外，氧化应激也会引起线粒体的严重损害，线粒体内积聚的ROS可使其DNA突变、脂质过氧化，从而影响线粒体的功能，线粒体严重损害还可引起胞体自噬、自噬性细胞死亡、凋亡和坏死[19]。研究[20]显示，不同种类的抗菌药物可能通过激活呼吸链电子传递，诱导大量的ROS积累而参与杀菌，对于致死浓度的抗菌药物而言，抗菌共有通路产生的ROS参与并促进抗生素杀菌，进而减少细菌数目，并减少耐药菌产生机会，进一步证实氢氧机产生的氢氧混合气体和唑类抗真菌药对真菌孢子具有协同杀伤作用。相关研究[21]发现，经呼吸道吸入氢气可改善众多疾病模型中的组织损伤，如肺、脑、心、肾、皮肤、鼻等，特别是在慢性阻塞性肺疾病合并深部真菌感染的治疗中，氢氧混合气呼吸疗法不仅可降低气体在小气道中的流速阻力，提高氧气的利用度，减轻慢性阻塞性肺疾病症状，而且对深部真菌感染有一定的协同治疗作用，提升了整体治疗效果。
综上所述，氢氧机通气具有安全、易操作等特点，且单独氢氧机通气处理即可实现高达93.5%的菌株杀伤效果，将其与抗真菌药联用还可进一步降低抗真菌药对真菌的MIC, 其机制可能与氢氧机能增强真菌细胞内ROS活性有关。本研究可为氢氧机在真菌感染辅助治疗中的临床应用提供一定的参考依据，但本研究选取的试验菌株为临床常见的深部真菌感染菌株，氢气单独或联合抗真菌药是否对广谱真菌亦有直接杀伤或协同杀伤效果还需在后续研究中进一步证实。
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图 2 各菌株经不同时间通气处理后的残余孢子数量比较
两者比较, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1, ns为P>0.05。
表 1 通气不同时间后各菌株的孢子存活率
% 菌株 菌种 0 min 5 min 10 min 382 耳念珠菌 100.0 79.1 50.3 387 耳念珠菌 100.0 80.6 76.1 389 耳念珠菌 100.0 93.7 70.5 Z1 新生隐球菌 100.0 23.8 6.5 Z2 新生隐球菌 100.0 89.7 81.0 Z3 新生隐球菌 100.0 89.1 75.5 SC5314 白念珠菌 100.0 50.4 46.6 ATCC00279 克柔念珠菌 100.0 27.5 17.4 ATCC22019 近平滑念珠菌 100.0 62.2 53.9 R9 耐氟康唑白念珠菌 100.0 91.0 76.9 R14 耐氟康唑白念珠菌 100.0 98.6 97.3 R15 耐氟康唑白念珠菌 100.0 83.6 81.3 
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表 2 4种抗真菌药对12株真菌的体外药敏试验最低抑菌浓度结果
μg/mL 菌株编号 种属 ITR VOR POS FLU 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min AR387 耳念珠菌 0.125 0.125 0.125 0.250 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 64.000 64.000 64.000 AR389 耳念珠菌 2.000 1.000 1.000 4.000 2.000 2.000 1.000 0.500 0.250 4.000 2.000 2.000 R9 白念珠菌 1.000 0.250 0.250 0.500 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 4.000 2.000 1.000 R14 白念珠菌 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.250 0.250 4.000 2.000 2.000 R15 白念珠菌 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.500 0.250 0.125 8.000 4.000 4.000 Z1 新生隐球菌 0.250 0.250 0.250 0.031 0.031 0.031 0.250 0.250 0.250 2.000 1.000 1.000 Z2 新生隐球菌 0.125 0.063 0.063 0.031 0.031 0.031 0.250 0.250 0.250 2.000 0.500 0.500 Z3 新生隐球菌 0.250 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 0.500 0.250 0.250 4.000 4.000 2.000 SC5314 白念珠菌 0.250 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.063 0.063 0.500 0.125 0.125 ATCC00279 克柔念珠菌 0.250 0.125 0.063 0.125 0.125 0.063 0.500 0.250 0.031 0.250 0.250 0.063 ATCC22019 近平滑念珠菌 0.250 0.250 0.063 0.125 0.125 0.063 0.500 0.250 0.250 2.000 1.000 0.063 AR382 耳念珠菌 4.000 2.000 1.000 4.000 1.000 0.250 4.000 2.000 0.500 64.000 64.000 64.000 ITR: 伊曲康唑; VOR: 伏立康唑; POS: 泊沙康唑; FLU: 氟康唑。
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