Expression of programmed cell death-ligand 1 of tumor-associated macrophages and its relationship with adverse prognosis of breast cancer
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摘要:目的
探讨肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中程序性死亡受体配体1(PD-L1)的表达及其与乳腺癌不良预后的关系。
方法通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据库、肿瘤微环境单细胞转录组学数据库(TISCH)数据集分析165例乳腺癌患者免疫细胞中PD-L1的表达。采用多色免疫荧光法检测PD-L1在乳腺癌TAMs中的表达。诱导THP-1单核细胞至M2型极化, 并与乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231共培养24 h; 通过蛋白质印迹(Western blot)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TAMs中的PD-L1表达。
结果与原发性乳腺癌相比，转移癌TAMs中PD-L1表达上调，差异有统计学意义(P < 0.05)。TAMs中PD-L1表达与乳腺癌组织学分级呈正相关(P=0.001), 与年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、分子亚型和远处转移无相关性(P>0.05)。高密度PD-L1+TAMs浸润提示预后不良。M2型巨噬细胞与MCF-7或MDA-MB-231细胞系共培养后, TAMs中PD-L1 mRNA及PD-L1蛋白表达水平增高。
结论乳腺癌组织TAMs中PD-L1的表达与乳腺癌患者的组织学分级和不良预后显著正相关，且乳腺癌细胞可刺激M2型巨噬细胞(TAMs的主要成分)的PD-L1表达。
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关键词:
- 乳腺癌 /
- 肿瘤微环境 /
- 肿瘤相关巨噬细胞 /
- 程序性死亡受体配体1 /
- 不良预后
Abstract:ObjectiveTo explore the expression of programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) of tumor-associated macrophages (TAMs) and its relationship with adverse prognosis of breast cancer.
MethodsThe expression of PD-L1 in immune cells of 165 breast cancer patients was analyzed by single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) database and tumor immune single-cell hub (TISCH) dataset. Multicolor immunofluorescence was used to detect the expression of PD-L1 in breast cancer TAMs. THP-1 monocytes were induced to m2-type polarization and co-cultured with breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 for 24 h; the expression of PD-L1 in TAMs was detected by western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
ResultsPD-L1 expression was significantly upregulated in metastatic TAMs compared with primary breast cancer(P < 0.05). The expression of PD-L1 in TAMs was positively correlated with the histological grade of breast cancer (P=0.001), but had no correlation with the patientś age, tumor size, lymph node metastasis, molecular subtype and distant metastasis (P>0.05). High density PD-L1+TAMs infiltration suggested a poor prognosis. When M2-type macrophages were co-cultured with MCf-7 or MDA-MB-231 cell lines, the expression levels of PD-L1 mRNA and PD-L1 protein in TAMs increased.
ConclusionThe PD-L1 expression in breast cancer tissue TAMs is significantly positively correlated with histological grade and poor prognosis of breast cancer patients, and breast cancer cells can stimulate PD-L1 expression in M2-type macrophages (the main component of TAMs).
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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是女性癌症的第二大死亡原因[1]。肿瘤微环境(TME)是肿瘤研究的热点，其主要由癌细胞及大量浸润性巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞组成[2]。乳腺癌细胞可招募肿瘤相关巨噬细胞(TAMs), 肿瘤组织中高密度的TAMs浸润与乳腺癌患者的不良预后相关[3]。程序性死亡受体配体1(PD-L1)在乳腺癌中表达的研究较多，但其预后意义尚未完全清楚。原发性乳腺癌中癌细胞PD-L1的表达与高危临床病理参数和不良预后相关[4]。癌细胞上高表达PD-L1的患者在进行新辅助化疗后获得病理完全缓解的可能性增加，而癌细胞低表达PD-L1的患者具有更好的总体生存率(OS)[5]。乳腺癌中关于PD-L1的研究主要集中于癌细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中PD-L1的表达[6]。TAMs是TME中PD-L1表达的主要来源，且TAMs上PD-L1的表达比癌细胞上的更稳定[7]。目前，有关巨噬细胞中PD-L1表达的研究较少。本研究检测PD-L1在TAMs中的表达及其与临床病理的相关性，探讨其可能的机制，为乳腺癌的治疗提供新的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 生物信息学分析
使用肿瘤微环境单细胞转录组学数据库(TISCH)获取乳腺癌肿瘤组织单细胞水平转录组学信息。79个数据集中的4个数据集预测了TAMs中编码PD-L1的RNA(命名为CD274)的表达(http://tisch.comp-genomics.org/search-gene/)。所有参数均设置为默认值。
1.2 患者队列
本研究由医院研究伦理委员会批准，并根据方案2019MHZ032进行。收集2014年1月—2019年12月复旦大学附属上海市第五人民医院病理科165例浸润性乳腺癌患者组织及相关临床病理资料。165例患者中，82例有淋巴结转移, 83例无淋巴结转移; 年龄29~88岁，中位年龄59岁。福尔马林固定的石蜡包埋组织切成4 μm的切片。根据世界卫生组织肿瘤分类标准，由病理医生进行诊断。
1.3 多色免疫荧光组织染色及抗体
所有组织均用福尔马林固定，常规技术包埋于石蜡中。组织切片(4 μm)经脱蜡、返水，并在0.1 mol/L柠檬酸钠(pH 6.0)中进行微波抗原修复，染色前用5%的羊血清封闭20 min。将载玻片上滴加2种抗体[CD68(KP1, ab955, Abcam, 1 ∶ 25)]和PD-L1(SP142, CST, 1 ∶ 250)的混合物(2种抗体来自不同的种属)，在4 ℃冰箱中孵育过夜；然后在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤载玻片，于暗室中与2种二抗的混合物[异硫氰酸荧光素(FITC)或Tesas红结合]37 ℃温箱中孵育1 h; 然后将载玻片在PBS中洗涤，并用Hoechst(ab228551, Abcam, 1 ∶ 1 000)孵育30 s进行复染，使细胞核着色；然后在自来水中短暂冲洗载玻片，封片。立即使用荧光显微镜(蔡司)观察并拍照。
1.4 免疫荧光染色的评估
荧光显微镜低倍镜下观察切片中CD68+PD-L1+细胞密集区域，从每个切片中选择5个高倍视野(放大400倍)计数，取平均值即为该组织切片中PD-L1+TAMs浸润数量。取PD-L1+TAMs计数的中位数，平均值大于中位数即为PD-L1高表达，否则为低表达。
1.5 患者的生存预后
通过门诊或电话定期回访患者。总生存期定义为患者确诊至任何原因导致死亡的时间。随访时间截至2021年12月或死亡。OS测量了所有病例的死亡率，用于预后分析。
1.6 细胞培养和试剂
THP-1单核细胞在添加10% 胎牛血清(FBS)(Gibco)和0.05 mmol/L β-聚体(Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中培养。MCF-7和MDA-MB-231细胞在完全RPMI 1640培养基中培养。所有细胞系每2周检查1次支原体，使用前均为阴性。
佛波酯(PMA)购自Sigma Aldrich。白细胞介素(IL)-4和IL-13购自PeproTech。THP-1单核细胞经100 nmol/L PMA孵育72 h后，在RPMI培养基中孵育24 h分化为巨噬细胞。添加20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13孵育获得M2型巨噬细胞。在共培养实验中, THP-1单核细胞以100 000个细胞/孔的密度接种在24个Transwell板(康宁)中。巨噬细胞与MCF-7/MDA-MB-231细胞共培养24 h。
1.7 蛋白质印迹(Western blot)
使用Bio-Rad的标准Western blot方案。收集M2型巨噬细胞，提取蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量。取30 mg总蛋白/泳道装入凝胶中。使用抗PD-L1和vinculin(Sigma)的抗体来检测蛋白质，并用过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗(Abcam)孵育。使用ImageJ软件进行密度分析以量化条带面积。
1.8 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
RNA提取和实时定量PCR, 使用Trizol试剂提取总RNA，使用SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis for RT-PCR (Invitrogen, 18080-051)试剂盒合成cDNA，按照说明书使用PerfectStartTM Green qPCR SuperMix (Tran，AQ601)试剂盒进行RT-PCR。热循环条件如下: 95 ℃初始激活30 s, 95℃进行40次循环10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s。实验分复孔进行。以β-actin为参照，使用2-△△Ct方法计算PD-L1基因组转录本的相对表达水平，正向和反向引物见表 1。
表 1 引物序列引物 序列(5′- 3′) PD-L1正向引物 GCTGCACTAATTGTCTATTGGGA PD-L1反向引物 AATTCGCTTGTAGTCGGCACC β-actin正向引物 CACCATTGGCAATGAGCGGTTC β-actin反向引物 AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT 1.9 统计学分析
所有分析均使用SPSS 18.0进行。PD-L1表达与患者临床病理特征之间的相关性采用χ2检验或Fisher′s精确检验进行评估。Kaplan-Meier方法用于估计OS, 对数秩检验用于比较亚组。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 原发性乳腺癌组织和转移癌中PD-L1的表达
通过TISCH进行scRNA-seq分析，结果表明，转移性乳腺癌组织中巨噬细胞PD-L1的表达高于原发性乳腺癌组织，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 1。
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图 1 原发性乳腺癌组织和转移瘤中巨噬细胞PD-L1的表达A、B: 原发性乳腺癌; C、D: 转移性乳腺癌; E: 原发性乳腺癌(BRCA_GSE114727、BRCA_GSE138536)、转移性乳腺癌(BRCA_GSE110686、BRCA_GSE143423)2.2 乳腺癌TAMs中PD-L1的表达
在乳腺癌组织样本的间质和癌细胞中均可观察到PD-L1和CD68的表达，其表达主要定位于细胞质中，呈颗粒状(图 2)。为了检测乳腺癌TAMs(CD68阳性细胞)中PD-L1的表达，从每个切片选取5个高密度区域计算PD-L1+CD68+(图 1中黄色部分所示)细胞的数量, 165例乳腺癌患者的中位数为(19.24±10.01)/高倍视野。为了研究TAM中PD-L1表达与临床病理特征之间的关系，根据PD-L1+CD68+细胞的中位数将乳腺癌患者分为PD-L1高表达组和PD-L1低表达组(图 2)。
2.3 患者的临床病理特征及其与TAMs中PD-L1表达的相关性
165例乳腺癌患者均为女性, 122例患者年龄≥50岁, 43例年龄 < 50岁; 72例患者肿瘤≤2 cm, 78例患者肿瘤>2 ~5 cm, 15例患者肿瘤>5 cm。其中83例患者无淋巴结转移, 43例患者1~3个淋巴结转移阳性, 20例患者4~9个淋巴结转移阳性, 19例有≥10个淋巴结转移阳性。诊断时，6例患者处于Ⅰ期, 62例患者处于Ⅱ期, 97例患者处于Ⅲ期或Ⅳ期。PD-L1+TAMs浸润密度与组织学分级相关(P < 0.05), PD-L1+TAMs浸润与年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、分子亚型和远处转移无相关性(P>0.05)。见表 2。
表 2 患者临床病理特征及其与TAMs中PD-L1表达的关系病理特征 分类 PD-L1+ M2 TAMs χ2 P 低表达(n=83) 高表达(n=82) 年龄 < 50岁 19 24 0.870 0.379 ≥50岁 64 58 肿瘤直径 ≤2 cm 40 32 2.601 0.272 2~5 cm 38 40 >5 cm 5 10 淋巴结转移 0 47 36 2.707 0.439 1~3个 19 24 4~9个 9 11 >10个 8 11 组织学分级 Ⅰ级 5 1 14.566 0.001 Ⅱ级 41 21 Ⅲ~Ⅳ级 37 60 分子分型 Luminal A 13 14 Luminal B 51 45 人类表皮生长因子受体2过表达 19 23 0.787 0.675 远处转移 无 73 69 0.498 0.480 有 10 13 2.4 乳腺癌患者PD-L1+TAMs浸润密度与生存时间呈负相关
随访期间12例患者死于乳腺癌，最短生存时间为1个月。采用Kaplan-Meier生存分析, PD-L1+TAMs高表达和低表达患者的平均生存时间分别为88.70和78.58个月。PD-L1+TAMs高表达和低表达患者的生存曲线不同。PD-L1+TAMs的高表达与较差的OS相关(P=0.014)。见图 3。
2.5 巨噬细胞中PD-L1的表达
通过与PMA、IL-4和IL-13孵育将THP-1单核细胞诱导为M2型巨噬细胞，并检测其中PD-L1的表达。Western blot结果显示与MCF-7或MDA-MB-231细胞共培养24 h后, M2型巨噬细胞中PD-L1蛋白表达水平增加(P < 0.05或P < 0.001)。见图 4。在与MCF-7或MDA-MB-231细胞共同培养的M2型巨噬细胞中, PD-L1 mRNA丰度更高(P < 0.05或P < 0.001), 见图 5。
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图 4 M2型巨噬细胞中PD-L1的表达。A: M2型巨噬细胞与MCF-7细胞系共培养24 h; B: M2型巨噬细胞与MDA-MB-231细胞系共培养24 h。与M2型巨噬细胞中PD-L1表达比较, *P < 0.05, ***P < 0.001。![]()
图 5 M2型巨噬细胞PD-L1 mRNA表达水平。A: M2型巨噬细胞与MCF-7细胞系共培养24 h; B: M2型巨噬细胞与MDA-MB-231细胞系共培养24 h。与M2型巨噬细胞中PD-L1 mRNA表达比较, *P < 0.05, ***P < 0.001。3. 讨论
乳腺癌是一种严重影响女性身心健康的恶性肿瘤，目前主要治疗方法为手术切除、局部放疗和化疗[1]。M2型TAMs与多种癌症的生长、迁移和侵袭有关。同时, M2型TAMs也可能通过表达免疫检查点蛋白PD-L1/程序性死亡受体配体2(PD-L2) 和CD80/CD86促进免疫监视肿瘤逃逸，使TAMs成为免疫检查点抑制剂程序性死亡受体-1(PD-1)的直接靶点[8-9]。抑制M2型TAM中IL-10/STAT3/NF-κB信号通路，可阻断免疫抑制性TME的发展[8]。目前，多种针对肿瘤相关巨噬细胞的治疗策略已经被开发[9-13]。
本研究结果显示，原发性乳腺癌TAMs中PD-L1的表达与组织学分级显著正相关; 原发性乳腺癌中PD-L1+TAMs的浸润密度与患者的生存时间呈负相关; 与肿瘤组织TAMs中PD-L1低表达患者相比, PD-L1高表达患者总体生存率更差。TME在肿瘤侵袭和转移中的作用受到广泛关注[14]。目前, TME被认为是诊断治疗的靶点或预后的生物标志物。在免疫系统中, TAMs是癌症免疫抑制的主要驱动因素[15]。研究[4]表明，在乳腺癌患者中, TAMs浸润率高的患者OS较差。
乳腺癌中PD-L1的表达与高TIL水平和存在不良预后因素呈正相关[16]。肿瘤浸润性免疫细胞中PD-L1阳性表达与较差的OS显著相关。本研究中, PD-L1+TAMs浸润数量越多, OS越差。TISCH的scRNA-seq数据显示，与原发性乳腺癌相比，转移时巨噬细胞中PD-L1的表达显著上调。乳腺肿瘤组织PD-L1+TAMs浸润密度与患者生存时间呈负相关，高密度组的总体生存率显著降低。提示PD-L1+TAMs的高度浸润性是乳腺癌免疫逃逸的一个重要因素，这与单细胞分析[17]的结果一致。巨噬细胞具有显著可塑性，使其能够有效地适应环境变化，并改变表型和生理学特性[15]。巨噬细胞的异质性最初被描述为2大类: M1(经典激活)和M2(交替激活)，大多数TAMs更倾向于M2型巨噬细胞[18-19]。本研究发现，极化后M2型巨噬细胞中PD-L1的表达显著高于THP-1单核细胞。本研究将M2型巨噬细胞与乳腺癌细胞系MCF-7或MDA-MB-231共培养24 h, TAMs中 PD-L1 mRNA及PD-L1蛋白表达水平增高。相关研究[20-21]显示, 4T1细胞共培养后，巨噬细胞PD-L1水平增加; 口腔鳞状细胞癌患者的原代肿瘤细胞可通过IL-10刺激单核细胞上的PD-L1表达，与本研究结果一致。既往研究[6]表明, PD-L1表达主要通过I型和II型干扰素信号途径调节。一项研究[22]表明，TNF-α是一种细胞因子，可导致单核细胞PD-L1表达上调。TAMs中PD-L1表达的调节方式可能与肿瘤细胞自身不同。故PD-L1的表达是TAMs的一个重要特征，其调控理论有待进一步探讨。
综上所述，乳腺癌组织TAMs中PD-L1的表达是相关不良临床结果的独立预后因素。TAMs中PD-L1阳性表达与组织学分级和不良预后显著正相关，可能在肿瘤进展中起重要作用。靶向TAMs中的PD-L1可能为乳腺癌治疗提供一种新的治疗方法。但本研究存在一定局限性，本研究未明确调节TAMs中PD-L1表达的潜在信号通路，其次仅探讨了M2型TAMs中PD-L1的表达，以及未证实TAMs中PD-L1的表达在抗PD1/PD-L1治疗中的预测价值，仍需进一步研究阐明。
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图 1 原发性乳腺癌组织和转移瘤中巨噬细胞PD-L1的表达
A、B: 原发性乳腺癌; C、D: 转移性乳腺癌; E: 原发性乳腺癌(BRCA_GSE114727、BRCA_GSE138536)、转移性乳腺癌(BRCA_GSE110686、BRCA_GSE143423)
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图 4 M2型巨噬细胞中PD-L1的表达。
A: M2型巨噬细胞与MCF-7细胞系共培养24 h; B: M2型巨噬细胞与MDA-MB-231细胞系共培养24 h。与M2型巨噬细胞中PD-L1表达比较, *P < 0.05, ***P < 0.001。
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图 5 M2型巨噬细胞PD-L1 mRNA表达水平。
A: M2型巨噬细胞与MCF-7细胞系共培养24 h; B: M2型巨噬细胞与MDA-MB-231细胞系共培养24 h。与M2型巨噬细胞中PD-L1 mRNA表达比较, *P < 0.05, ***P < 0.001。
表 1 引物序列
引物 序列(5′- 3′) PD-L1正向引物 GCTGCACTAATTGTCTATTGGGA PD-L1反向引物 AATTCGCTTGTAGTCGGCACC β-actin正向引物 CACCATTGGCAATGAGCGGTTC β-actin反向引物 AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT 
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表 2 患者临床病理特征及其与TAMs中PD-L1表达的关系
病理特征 分类 PD-L1+ M2 TAMs χ2 P 低表达(n=83) 高表达(n=82) 年龄 < 50岁 19 24 0.870 0.379 ≥50岁 64 58 肿瘤直径 ≤2 cm 40 32 2.601 0.272 2~5 cm 38 40 >5 cm 5 10 淋巴结转移 0 47 36 2.707 0.439 1~3个 19 24 4~9个 9 11 >10个 8 11 组织学分级 Ⅰ级 5 1 14.566 0.001 Ⅱ级 41 21 Ⅲ~Ⅳ级 37 60 分子分型 Luminal A 13 14 Luminal B 51 45 人类表皮生长因子受体2过表达 19 23 0.787 0.675 远处转移 无 73 69 0.498 0.480 有 10 13
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