麻醉过程中的缺氧是心肌缺血最重要的病因，可诱发心肌细胞凋亡、氧自由基的累积等，进而导致细胞死亡，引发心肌梗死。因此，如何保护麻醉过程中心肌细胞损伤成为研究的重点。右美托咪定(Dex)是近年来出现的高选择性α₂肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛和抗焦虑功效，对人体呼吸功能抑制性较弱，代谢快，不良反应少^[1]。临床研究^[2]发现, Dex可显著减少术后心肌缺血再灌注损伤发生率，提示Dex对心脏具有保护功能。张莹莹等^[3]研究发现，心脏瓣膜置换术中使用Dex可保护心肌功能。此外，动物实验^[4-5]同样表明，Dex可保护缺氧-复氧心肌细胞。但Dex对心肌细胞的保护作用机制尚处于探索阶段。微小RNA(miRNA)参与细胞的多种生物学行为，研究^[6-7]发现，miRNA修复缺氧/复氧心肌细胞损伤中发挥重要作用。研究^[8]显示，慢性心力衰竭患者血浆miR-138-5p水平呈低表达，上调miR-138-5p可促进缺氧/复氧心肌细胞的增殖，抑制凋亡。然而, miR-138-5p调控缺氧/复氧心肌细胞损伤的机制及其与Dex的关系尚不清楚。本研究探讨了Dex对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用及其对miR-138-5p的影响。

1.   材料与方法

1.1   细胞、试剂及仪器

H9C2心肌细胞(苏州海星生物科技有限公司)，盐酸右美托咪定(天津一方科技有限公司)，DMEM/F12培养基、双抗、胎牛血清(南京森贝伽生物科技有限公司)，细胞凋亡检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)酶联反应检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)酶联反应检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，CCK-8检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，兔抗人白细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)一抗(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis试剂盒(日本takara公司)，TRIzol(上海联迈生物工程有限公司)，空质粒(Vector)、miR-138-5p mimic、突变型(MUT)-性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、野生型(WT)-SOX9载体(沈阳万通生物有限公司)，Lipofectamine 3000(上海传秋生物科技有限公司)，萤光素酶报告基因酶法试剂盒(Luciferase Reporter Gene, 上海西唐生物科技有限公司), ABI7500PCR仪(美国ABI公司)，多功能酶标仪(杭州优米仪器有限公司), Tanon V8快速蛋白质印迹系统(武汉华科达实验设备有限公司)。

1.2   细胞培养、分组

H9C2细胞使用完全DMEM/F12培养基(包含0.1%双抗、10%胎牛血清)进行培养，培养条件为37 ℃、5% CO₂。待细胞融合到80%左右时进行传代，取传代3次的细胞进行后续实验。将正常培养的细胞设为对照组。H9C2细胞首先用无血清DMEM/F12培养基在95% N₂+5% CO₂的条件下孵育2 h，然后使用完全DMEM/F12培养基, 37 ℃、5% CO₂条件下孵育6 h, 最后培养成缺氧/复氧(H/R)细胞。

用含有10 nmol/L Dex的完全DMEM/F12培养基孵育H9C2细胞24 h，然后进行H/R处理，将其设定为H/R+Dex组。将Vector、miR-138-5p mimic质粒转染至H9C2细胞后进行H/R处理，分别设定为H/R+Vector组、H/R+miR-138-5p组。将Vector、miR-138-5p mimic质粒分别与MUT-SOX9、WT-SOX9载体结合，共同转染至H9C2细胞，将得到的转染细胞分为MUT-SOX9+Vector组、MUT-SOX9+miR-138-5p组、WT-SOX9+Vector组及WT-SOX9+miR-138-5p组。

1.3   酶联免疫反应吸附法(ELISA)检测上清液指标水平

收集各组细胞上清液，以2 000转/min离心5 min，将上清液转移至新的离心管中。按照试剂盒说明书检测上清液中MDA、SOD、LDH、TNF-α及IL-6含量。

1.4   CCK-8检测细胞增殖

将各组细胞接种到96孔(1 000个细胞/孔)，并进行不同处理24 h后加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h, 检测450 nm吸光度值。

1.5   流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞培养24 h后用胰酶消化，制备单细胞悬液(2×10⁵个/mL), 然后分别加入5 μL Annexin V-FITC、氯化丙定(PI)，避光孵育15 min。上机检测细胞凋亡率。

1.6   实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-138-5p表达

向各组细胞中加入Trizol提取总RNA, 利用反转录试剂盒合成cDNA, 体系如下: mRQ Buffer (2x) 5 μL, RNA sample 3.75 μL, mRQ Enzyme 1.25 μL, 总体积10 μL, 随后进行qRT-qPCR，体系如下: ddH₂O 9.0 μL, TB Green Advantage Premix (2X) 12.5 μL, ROX Dye (50X) 0.5 μL, miRNA-specific primer (10 μmol/L)及mRQ 3′ Primer (10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA 2.0 μL。反应条件: 95 ℃ 10 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 95 ℃ 60 s, 55 ℃ 30 s, 95 ℃ 30 s。内参选择U6, 采用2^-△△Ct法表示miR-138-5p相对表达量。miR-138-5p上游引物: 5′- CCGATAAGACGAACAA-3′, 下游引物: 5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′; U6上游引物: 5′-GTTGCGGGTGTCCGAATG-3′, 下游引物: 5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。

1.7   Weston blot检测TNF-α、IL-6、Bcl-2、Bax及SOX9的表达

使用RIPA提取细胞总蛋白，测量浓度。配制浓缩胶、分离胶后向槽中加入约20 μg的蛋白, 70~110 V下分离蛋白，然后将蛋白转移只PVDF膜上，5%脱脂牛奶常温下封闭1 h, 加入TNF-α(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)及SOX9(1∶1 000), 4 ℃冰箱孵育过夜，次日加入对应的二抗(1∶1 000)室温孵育1 h, 曝光, Image J分析灰度值，使用目的蛋白/内参β-actin比值表示表达量。

1.8   荧光素酶报告实验

通过target网站(http://www.targetscan.org)分析miR-138-5p与SOX9基因的结合核苷酸序列。将miR-NC、miR-138-5p mimic与MUT-SOX9、WT-SOX9分别两两结合共同转染至H9C2细胞中，孵育48 h, 使用细胞裂解液裂解后保留上清液检测荧光素酶活性。

1.9   统计学方法

使用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较行t检验，多组间单因素方差分析比较行q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   Dex对H/R细胞增殖的影响

H/R组细胞吸光度值为(0.83±0.07), 低于对照组的(2.01±0.13), 差异有统计学意义(t=13.84, P < 0.001); H/R+Dex组细胞吸光度值为(1.68±0.11), 高于H/R组，差异有统计学意义(t=11.29, P < 0.001)。

2.2   Dex对H/R细胞凋亡的影响

H/R组细胞凋亡率、Bax蛋白表达量分别为(19.93±2.03)%、(0.93±0.07), 高于对照组的(5.14±0.21)%、(0.89±0.11), Bcl-2蛋白表达量为(0.21±0.04), 低于对照组的(0.46±0.08), 差异有统计学意义(P < 0.001); H/R+Dex组细胞凋亡率、Bax蛋白表达量分别为(8.32±0.53)%、(0.31±0.03), 低于H/R组, Bcl-2蛋白表达量为(0.78±0.09), 高于H/R组，差异有统计学意义(P < 0.001)。见图 1。

图  1  各组细胞凋亡率、Bcl-2及Bax表达量比较

A: 对照组典型凋亡图; B: H/R组典型凋亡图; C: H/R+Dex组典型凋亡图; D: 各组细胞凋亡相关蛋白表达。

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   Dex对H/R细胞炎性因子、MDA、SOD、LDH表达的影响

H/R组细胞MDA、LDH、TNF-α、IL-6表达量高于对照组, SOD表达量低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.001); H/R+Dex组细胞MDA、LDH、TNF-α、IL-6表达量低于H/R组, SOD表达量高于H/R组，差异有统计学意义(P < 0.001)。见表 1、2。

表  1  各组细胞MDA、SOD、LDH表达水平比较(x±s)

组别	MDA/(nmoL/L)	SOD/(U/mL)	LDH/(U/mL)
对照组	10.79±1.44	120.88±10.33	2.08±0.17
H/R组	66.71±6.92**	30.11±4.27**	9.04±0.34**
H/R+Dex组	19.35±2.02##	96.38±8.84##	3.52±0.32##
MDA: 丙二醛; SOD: 超氧化物歧化酶; LDH: 乳酸脱氢酶。与对照组比较, **P < 0.001; 与H/R组比较, ##P < 0.001。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

表  2  各组细胞炎性因子和蛋白表达水平比较(x±s)

组别	TNF-α/(pg/mL)	IL-6/(pg/mL)	TNF-α蛋白	IL-6蛋白
对照组	19.54±2.49	26.17±4.05	0.76±0.11	0.87±0.11
H/R组	163.09±13.31*	216.45±19.33**	1.63±0.33**	1.77±0.22**
H/R+Dex组	19.35±2.02##	87.95±10.03##	0.96±0.22##	1.01±0.12##
TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; IL-6: 白细胞介素-6。与对照组比较, **P < 0.001; 与H/R组比较, ##P < 0.001。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   Dex对H/R细胞miR-138-5p、SOX9表达的影响

H/R组细胞SOX9蛋白表达量高于对照组, miR-138-5p表达量低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.001); H/R+Dex组细胞SOX9表达量低于H/R组, miR-138-5p表达量高于H/R组，差异有统计学意义(P < 0.001)。见表 3。

表  3  各组细胞miR-138-5p、SOX9表达水平比较(x±s)

组别	miR-138-5p	SOX9蛋白
对照组	1.06±0.05	26.17±4.05
H/R组	0.12±0.02**	216.45±19.33**
H/R+Dex组	0.66±0.12##	87.95±10.03##
miR-138-5p: 微小RNA-138-5p; SOX9: 性别决定区Y框蛋白9。与对照组比较, **P < 0.001; 与H/R组比较, ##P < 0.001。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.5   miR-138-5p对H/R细胞增殖的影响

H/R+miR-138-5p组细胞miR-138-5p表达量为(1.65±0.15), 吸光度值为(1.64±0.13), 分别高于H/R+Vector组的(0.13±0.03)、(0.83±0.07), 差异有统计学意义(t=17.21, 9.502, P < 0.001)。

2.6   miR-138-5p对H/R细胞凋亡的影响

H/R+miR-138-5p组细胞凋亡率为(5.14±0.21)%, Bax蛋白表达量为(0.41±0.11), 分别低于H/R+Vector组的(19.88±4.05)%和(0.95±0.13), Bcl-2表达量为(0.43±0.12), 高于H/R+Vector组的(0.14±0.04), 差异均有统计学意义(P < 0.001)。见图 2。

图  2  2组细胞凋亡率、Bcl-2蛋白及Bax表达量比较

A: H/R+Vector组典型细胞凋亡图; B: H/R+miR-138-5p组典型细胞凋亡图; C: 2组细胞凋亡相关蛋白表达。

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.7   miR-138-5p对H/R细胞炎性因子、MDA、SOD、LDH表达的影响

H/R+miR-138-5p组细胞MDA、LDH、TNF-α、IL-6表达量低于H/R+Vector组, SOD表达量高于H/R+Vector组，差异有统计学意义(P < 0.001)。见表 4、5。

表  4  2组细胞MDA、SOD、LDH表达水平比较(x±s)

组别	MDA/(nmoL/L)	SOD/(U/mL)	LDH/(U/mL)
H/R+miR-138-5p组	13.58±3.05	99.77±12.26	2.43±0.32
H/R+Vector组	66.67±6.75**	32.03±5.07**	9.15±1.22**
与H/R+miR-138-5p组比较, **P < 0.001。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

表  5  2组细胞炎性因子和蛋白表达水平比较(x±s)

组别	TNF-α/(pg/mL)	IL-6/(pg/mL)	TNF-α蛋白	IL-6蛋白
H/R+miR-138-5p组	22.16±2.27	35.37±5.11	19.54±2.49	26.17±4.05
H/R+Vector组	165.33±15.48**	220.75±21.15**	163.09±13.31**	216.45±19.33**
与H/R+miR-138-5p组比较, **P<0.001。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.8   miR-138-5p与SOX9的靶向关系

生物信息学分析发现, miR-138-5p与SOX9 3′UTR存在互补配对碱基对。H/R+miR-138-5p组细胞SOX9表达量低于H/R+Vector组，差异有统计学意义(P < 0.05)。

与WT-SOX9+Vector组比较, WT-SOX9+miR-138-5p组细胞SOX9表达量降低，差异有统计学意义(P < 0.05); MUT-SOX9+Vector组与MUT-SOX9+miR-138-5p组细胞SOX9表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图 3。

图  3  miR-138-5p与SOX9的靶向关系

A: miR-138-5p与SOX9 3′UTR互补配对碱基; B: 荧光素酶活性实验; C: SOX9蛋白表达量。*P < 0.05。

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

心肌缺血再灌注损伤严重影响患者的生命质量，严重时甚至引起患者死亡。Dex作为α₂肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、消炎等功能。研究^[9-10]表明, Dex对多种器官具有保护作用。李晓滨等^[11]研究发现, Dex通过调控miR-146a/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞内质网应激、氧化应激及凋亡，促进增殖。此外, WANG Z等^[12]研究发现, Dex通过miR-208b-3p/Med13/Wnt通路抑制缺氧/复氧心肌细胞凋亡，促进细胞增殖。但Dex保护缺氧心肌细胞的机制尚不明确。本研究通过构建H/R心肌细胞模型，观察Dex对心肌细胞的保护功能及机制，结果显示, H/R心肌细胞增殖受到抑制、发生凋亡，加入Dex后则可以促进细胞的增殖并抑制凋亡，提示Dex对H/R心肌细胞具有保护作用。炎症反应是缺血再灌注损伤的基础。TNF-α、IL-6作为重要的促炎因子，参与了心肌细胞的缺血再灌注损伤，抑制炎症反应可显著改善心肌细胞的生理功能^[13]。本研究结果显示, H/R心肌细胞TNF-α、IL-6表达明显升高，而Dex处理可抑制这些炎症因子的表达，提示Dex可通过降低H/R心肌细胞的炎症反应改善细胞损伤。氧化应激在心肌损伤中起到关键作用，心肌细胞发生损伤后，炎性因子、氧化应激反应可诱发线粒体功能失调，引起细胞内活性氧的产生，细胞出现凋亡^[14]。SOD、MDA和LDH是评估抗氧化系统状态的可靠指标，其中SOD可抑制细胞脂质过氧化反应，导致活性氧下降; 细胞损伤后MDA和LDH出现过表达，并释放至细胞外。本研究结果显示, Dex可降低MDA和LDH水平，提高SOD含量，提示Dex具有抗氧化应激的作用^[15]。

miR-138-5p与细胞炎症反应有关，参与心脏、脑血管及脊髓损伤的修复^[16-18]。SUN S等^[19]研究发现，下调miR-138-5p通过沉默调节蛋白1(SIRT1)促进心力衰竭的进展。此外, miR-138-5p在H/R心肌细胞中呈低表达，沉默miR-138-5p可上调心肌细胞炎性因子表达，促进细胞凋亡^[20]。刘青^[21]研究显示, miR-138-5p在H₂O₂诱导H9C2心肌细胞中呈低表达，上调miR-138-5p可抑制细胞炎性因子表达及氧化应激反应。本研究结果显示, H/R心肌细胞中miR-138-5p低表达，上调miR-138-5p可抑制H/R心肌细炎性因子表达，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖^[21]。此外，研究结果还表明，Dex处理H/R心肌细胞后可上调miR-138-5p表达，提示Dex可能通过miR-138-5p发挥其对心肌细胞的保护作用。

miRNA一般通过与下游靶基因结合发挥作用，为探索miR-138-5p的下游靶基因，本研究采用生物信息学分析法对其进行分析，结果发现miR-138-5p与SOX9 3′UTR区域存在结合位点，提示两者可能存在靶向关系。SOX9属于SOXE家族成员，参与细胞的多种生物学行为。研究^[22]发现，在缺血性心脏疾病心肌组织中SOX9表达上调。本研究结果表明, H/R心肌细胞中SOX9高表达，与一项研究^[22]结果基本一致。此外，上调miR-138-5p的心肌细胞中SOX9呈低表达，双荧光素酶实验进一步证实, miR-138-5p与SOX9存在负性调控关系。这些结果证实, miR-138-5p通过负性靶向调控SOX9保护H/R心肌细胞。

本研究存在一定局限性: 首先, miR-138-5p、SOX9与心肌缺血再灌注损伤的关系有待进一步在体内、体外进行实验验证；其次, Dex对心肌缺血再灌注损伤的保护作用有待进一步动物、人体实验进行验证；最后, Dex是否对通过其他miR发挥其保护作用需要进一步探讨。

综上所述, Dex可通过上调miR-138-5p抑制靶基因SOX9的表达，从而减轻H/R心肌细胞的炎症反应及氧化应激，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，最终发挥保护心肌的作用。