Role of calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ in reversingdrug resistance to cisplatin chemotherapy by verapamil in patients with lung adenocarcinoma cells
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摘要:目的 探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用。方法 在肺腺癌细胞系(A549)中，采用CCK-8法检测维拉帕米逆转顺铂耐药的能力，采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测维拉帕米逆转顺铂耐药中凋亡水平的效果，采用Western blotting检测逆转耐药过程中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表达水平的变化。结果 在肺腺癌细胞系(A549)中，单药顺铂组、顺铂联合维拉帕米组的细胞增长抑制率分别为(55.00±2.60) %、(32.30±1.80) %, 差异有统计学意义(P < 0.05)。凋亡实验表明，单药顺铂组细胞凋亡率为10.30%, 顺铂联合维拉帕米组为21.60%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。Western blotting结果显示，在A549细胞中，顺铂联合维拉帕米组P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表达明显低于单药顺铂组。结论 在肺腺癌细胞中, CaMKⅡ参与维拉帕米逆转化疗耐药的过程。
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关键词:
- 肺腺癌 /
- 维拉帕米 /
- 顺铂 /
- 耐药性 /
- 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ
Abstract:Objective To investigate the role of calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ(CaMKⅡ) in reversing drug resistance to cisplatin chemotherapy by verapamil in patients with lung adenocarcinoma cells.Methods In lung adenocarcinoma cell lines (A549), the CCK-8 method was used to detect the ability of verapamil in reversing the drug resistance to cisplatin chemotherapy, the Annexin V-FITC/PI method was used to detect the effect of verapamil on reversing the apoptosis of drug resistance to cisplatin chemotherapy, and the Western blotting was used to detect the expression levels of P-CaMKⅡ/CaMKⅡ protein in reversal process.Results In the A549 cell line, the inhibition rates of DDP group and DDP-VER combination group were (55.00±2.60) % and (32.30±1.80) % respectively, and there was significant difference between the two groups (P < 0.05). The apoptosis rates of DDP group and DDP-VRP combination group were 10.30% and 21.60% respectively, and there was significant difference between the two groups (P < 0.05). Western blotting results showed that the expression level of P-CaMKⅡ/CaMKⅡ protein in A549 cell line in DDP-VRP combination group was obviously lower than that in DDP group.Conclusion In lung adenocarcinoma cells, CaMKⅡ participates in the reversal process of drug resistance to cisplatin chemotherapy by verapamil. -
动脉粥样硬化(AS)所致的脑血管事件的发病率及病死率持续升高。AS是卒中的重要危险因素，其中颈动脉粥样硬化斑块的成分构成尤为重要，具有易损特性的颈动脉斑块易于引发缺血性脑血管事件，被称为症状性颈动脉斑块[1-2]。超声检查作为一种非侵入性影像学手段，能够通过分析颈动脉斑块超声图像的灰阶特点来评估斑块的成分构成[3-4]。斑块Gray-Weale(GW)分型能够根据灰阶图像特点量化评估颈动脉斑块的超声图像[5-6]。本研究通过应用斑块GW分型分析颈动脉斑块的超声图像，探讨症状性颈动脉斑块GW分型的分布特点，以实现对症状性颈动脉斑块的早期识别。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取2019年1月—2020年1月接受颈动脉多普勒超声检查且颈动脉分叉部存在AS斑块的患者60例为研究对象。排除大动脉炎患者，颈动脉支架及内膜剥脱术后患者，以及颈动脉完全阻塞者。60例受试者均签署知情同意书。根据60例患者6个月内是否出现过缺血性脑血管事件，将其分为症状组(n=32)与无症状组(n=28)[7], 其中症状组17例为非致残性卒中, 12例为一过性脑缺血发作, 3例为单眼黑矇。60例患者临床资料见表 1。
表 1 患者临床资料[n(%)](x ± s)一般资料 症状组(n=32) 无症状组(n=28) P 性别 男 >27(78.1) >15(53.6) >0.006 女 5(21.9) 13(46.4) 年龄/岁 64.0±7.0 61.0±6.0 0.33 体质量指数/(kg/m2) 24.2±2.7 23.1±3.6 0.61 吸烟史 26 (81.3) 15 (53.6) < 0.01 高血压病史 22 (68.8) 23 (82.1) 0.07 血脂 胆固醇/(mmol/L) 4.8±1.0 4.5±1.3 0.19 甘油三酯/(mmol/L) 1.6±0.7 1.6±0.8 0.73 高密度脂蛋白/(mmol/L) 1.1±0.3 1.2±0.5 0.07 低密度脂蛋白/(mmol/L) 2.7±1.0 3.0±1.1 0.11 卒中家族史 24 (75.0) 18 (64.3) 0.09 1.2 方法
本研究采用单盲设计原则，受试者超声检查由一名拥有5年年资的超声医生在不知晓实验分组情况下完成，使用西门子S2000多普勒超声诊断仪, L9-4线阵探头。超声检查过程依据《中国脑卒中血管超声检查指导规范》[4]。颈动脉斑块形态学超声参数为患者双侧颈动脉斑块数量、分叉部斑块厚度、分叉部斑块长度、斑块GW分型。症状组选取出现症状对侧颈动脉分叉部斑块作为代表性斑块，对照组选取斑块GW分型较低侧颈动脉分叉部斑块作为代表性斑块(双侧分叉部斑块出现同等GW分型，选取斑块厚度大者)。
1.2.1 斑块长度、厚度
颈动脉斑块定义为内中膜厚度≥1.5 mm, 或≥周边内中膜厚度50%以上的区域[4]。斑块最大长度在颈动脉长轴切面测量，斑块最大厚度在颈动脉短轴切面测量。
1.2.2 斑块GW分型
I型斑块特征为斑块90%的面积为无回声区或低回声区，超声检查中可能需要彩色多普勒显像才能清晰显示斑块边界; Ⅱ型斑块以无回声、低回声为主要声学特征，无、低回声面积大于斑块总面积的50%; Ⅲ型斑块中无、低回声面积小于斑块总面积的50%; Ⅳ型斑块以等、高回声为主，等、高回声区面积大于斑块总面积的90%; Ⅴ型斑块为因钙化产生的声影而无法清晰成像，以致无法分析斑块内部回声的斑块[5-6]。
颈动脉分叉部斑块GW分型的评估由2名不同年资的超声医生盲法进行，其中超声医生1具有5年以上超声检查经验，超声医生2仅接受6个月的超声检查培训。以超声医生1的诊断结果作为本实验最终数据。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0软件进行分析。计量资料采用( x ± s)表示，组间比较采用单因素方差分析, P < 0.05为差异有统计学意义。通过偏相关检验控制混杂因素，评估斑块厚度参数与斑块GW分型之间的相关性。以Cohen′s Kappa检验评估斑块GW分型指标的重复性。
2. 结果
2.1 患者临床资料
本研究共纳入患者60例，症状组32例，无症状组28例, 2组吸烟史、性别方面比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。
2.2 颈动脉斑块超声特性
症状组斑块厚度大于无症状组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2; 2组斑块GW分型比较，差异有统计学意义(F=3.718, P=0.049), 见表 3; 控制混杂因素性别与吸烟史, 60枚颈动脉斑块GW分型与斑块的厚度进行偏相关分析，二者呈负相关(r=-0.53, P < 0.01, n=60), 见图 1、2。
表 2 组间斑块超声形态学特性比较( x ± s)参数 症状组(n=32) 无症状组(n=28) 斑块数量/枚 4.00±2.00 2.00±1.00 斑块厚度/mm 5.01±0.77* 3.13±0.53 斑块长度/mm 21.63±12.74 18.34±13.46 与无症状组比较, * P < 0.05 表 3 组间斑块超声声学特性比较[n(%)]GW分型 症状组(n=32) 无症状组(n=28) Ⅰ 6(18.8) 2(7.1) Ⅱ 17(53.1) 7(25.0) Ⅲ 7(21.9) 17(60.7) Ⅳ 0 2(7.1) Ⅴ 2(6.3) 0 2.3 斑块GW分型重复性检验
2名不同年资超声医生对60枚颈动脉分叉部斑块GW分型的评估结果显示, 2组各出现斑块GW分型评估不一致斑块2枚，采用Cohen′s Kappa系数分析不同年资超声医生评估的一致性，统计分析显示Cohen′s Kappa系数为0.874(95%CI: 0.766 2~0.981 8, P < 0.001)。
3. 讨论
本研究结果表明，斑块GW分型可以半定量评估颈动脉斑块的超声图像，并可结合颈动脉斑块形态学超声参数来识别症状性颈动脉斑块。
首先，斑块GW分型能够对不同颈动脉斑块的灰阶图像做出稳定的半定量评估, Ⅴ型斑块因钙化成分影响无法评估其回声特性。本研究中的60枚代表性颈动脉分叉部斑块中，斑块GW分型成功分析58枚斑块(96.7%)的超声特性。Ⅴ型斑块有2枚，其中1枚斑块位于颈动脉分叉部前壁，大片状钙化灶位于斑块基底部，斑块内部因声影遮挡无法清晰成像; 另1枚斑块位于颈动脉分叉部后壁，斑块内部受多束声影遮挡，无法准确评估低、无回声区域在斑块总面积中的占比。虽然斑块GW分型可能受斑块内钙化灶的影响，但斑块GW分型对颈动脉斑块的评估成功率及稳定性依然较高。
其次，斑块GW分型能够提供客观的斑块声学特征评估，以帮助超声医生识别症状性颈动脉斑块。研究[8-9]表明，斑块厚度可以作为预测脑血管事件的重要参数。研究[10]表明，斑块在进展过程中会出现自我愈合的可能性，出现愈合进程的破裂斑块的组织学表现为约2/3斑块愈合处纤维帽下方出现较大脂质核心，约1/3出现较多纤维组织以及少部分脂质核心[11]。研究[12]表明，出现愈合进程的颈动脉斑块的形态学特征与冠状动脉斑块类似，出现层状异质构成，所以斑块厚度与斑块易损性并不呈线性相关。本研究发现，症状组斑块厚度大于无症状组斑块厚度，且斑块厚度与GW分型并不呈绝对负相关。
AS斑块的病理进程伴随着斑块内部成分构成的改变，有研究[13-15]通过分析斑块成分构成识别症状性颈动脉斑块，以识别易损病人。研究[15]发现，颈动脉斑块的脂质核心大小、斑块内纤维含量与患者单侧神经系统症状存在显著相关性。Ⅰ型和Ⅱ型斑块含脂质较多; Ⅲ型和Ⅴ型斑块含钙质较多，脂质较少; Ⅰ型和Ⅱ型斑块更不稳定，容易诱发缺血性脑血管事件[6-7]。本研究中，症状组中Ⅰ型及Ⅱ型斑块共23枚(71.9%), 无症状组中Ⅰ型及Ⅱ型斑块共9枚(32.1%)。症状性颈动脉斑块GW分型较低，多为Ⅰ型或Ⅱ型。随着AS斑块的进展，多数颈动脉斑块的厚度不断增大。Ⅲ型斑块相对较稳定，但斑块厚度与Ⅱ型和Ⅰ型斑块存在重合部分，故此不能排除存在斑块愈合的可能性; Ⅲ型斑块的异质性越高，提示其是愈合斑块的可能性越高[11-12], 因此对于症状性颈动脉斑块的判定、斑块的回声特性与斑块的形态学指标都需要考虑。
斑块GW分型操作者依赖性较低，重复性较高。本研究采用Cohen′s Kappa系数分析不同年资超声医生对60枚颈动脉分叉部斑块GW分型评估结果的一致性，其中56枚(93.3%)斑块GW分型结果一致，仅4枚(6.7%)斑块GW分型结果不一致, Cohen′s Kappa系数为0.874(95%CI: 0.766 2~0.981 8, P < 0.001), 具有较强一致性。症状组和无症状组各出现2枚GW分型不一致的颈动脉斑块，且均为Ⅱ型斑块与Ⅲ型斑块之间的混淆，此斑块GW分型能提供稳定的、半定量的及客观的斑块声学特征评估。
但本研究存在一定局限性，样本量偏小，且本研究通过医院信息系统选取受试患者，挑选6个月内出现缺血性脑血管事件的患者作为症状性颈动脉斑块的载体，存在一定的选择性偏倚。此外，本研究无症状组中部分患者没有接受脑CT检查，无法排除隐源性卒中的存在。
综上所述，斑块GW分型作为非侵入性量化超声成像手段，对AS斑块回声特性的评估稳定性与重复性较好。斑块GW分型可以作为筛查症状性颈动脉斑块的有效手段，并为临床动态观察AS斑块进展、疗效评估以及随访提供依据。
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图 1 维拉帕米逆转肺腺癌细胞顺铂化疗耐药的效果
NC为正常组, VER为维拉帕米组, DDP为顺铂单药组, DDP+VER为顺铂联合维拉帕米组。与DDP+VER比较, *P < 0.05。
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