摘要:
目的 构建靶向wnt-1基因的RNA干涉表达载体,转染人胶质瘤细胞U251中,研究该质粒的抑瘤效果.方法 根据siRNA设计原则,通过软件设计,选取含有21个核苷酸(21nt)靶序列,形成siRNA的DNA模板并克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,获得靶向抑制wnt-1基因表达的siRNA表达载体,并经酶切测序鉴定.用该干涉质粒转染U251细胞,通过逆转录PCR、Western blotting方法检测wnt-1基因mRNA和蛋白表达水平,用MTT法、流式细胞术初步评价对U251细胞的增生、细胞周期影响.结果 成功构建针对靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒,可显著抑制U251细胞wnt-1基因的mRNA和蛋白表达.MTT法分析转染细胞增生明显抑制,流式细胞仪分析细胞周期证实转染后比空白对照组受到阻滞.结论 靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒构建成功,并可特异性的沉默wnt-1基因蛋白表达,使细胞增长减慢,细胞周期阻滞,本实验通过wnt-1的RNA干涉,为由wnt-1介导的wnt信号通路在胶质瘤发病机制中的抑瘤作用提供了依据,并为进一步该基因的基因治疗临床实验提供了可靠基础.
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