可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

Purification and expression of H-2Kd-BSP fusion protein

摘要: 目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体.方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-22b高效表达载体多克隆位点,诱导表达后对表达产物进行纯化,用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白.结果成功构建 pET-H-2Kd原核表达载体,测序证实H-2Kd-BSP融合基因序列正确.pET-H-2Kd原核表达载体可在大肠杆菌BL21中高效诱导表达H-2Kd -BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的36%, 主要以包涵体形式表达;经反复洗涤纯化,纯化蛋白纯度可达90%以上.纯化蛋白可被H-2Kd 分子特异性单克隆抗体SF1-1.1所识别.结论可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2Kd -肽四聚体奠定了实验基础.